恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一,每年死于恶性肿瘤的患者高达数百万,造成劳动力的巨大损失和社会资源的惊人消耗,同时给患者及其家属带来巨大的经济和精神压力。因此恶性肿瘤已经成为全人类共同关注的重大课题。目前超顺磁氧化铁纳米粒的研究从最初侧重于MRI造影发展到目前的靶向给药、治疗和造影等。具有肿瘤靶向超顺磁氧化铁纳米粒由于其在MRI诊断、热疗及靶向给药中潜能,是目前靶向制剂研究中很热门的课题,本研究课题用三步法合成具有肿瘤靶向的超顺磁氧化铁纳米粒,并体内、体外考察其靶向性、细胞毒性和抗巨噬细胞吞噬作用等。目的1.制备肿瘤靶向的叶酸-羧甲基壳聚糖-超顺磁氧化铁纳米粒(Folic acid-o-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles (FA-OCMCS-SPIO-NPs)并对处方工艺进行优化。2.对中间产物(超顺磁氧化铁纳米粒和羧甲基壳聚糖超顺磁氧化铁纳米粒)及终产物(叶酸-羧甲基壳聚糖超顺磁氧化铁纳米粒)分别进行表征。3.体外评价FA-OCMCS-SPIO-NPs的细胞毒性、逃避吞噬细胞吞噬作用及叶酸受体肿瘤靶向作用。4.体内初步评价FA-OCMCS-SPIO-NPs的肿瘤靶向性及组织中分布情况。方法1三步法合成FA-OCMCS-SPIO-NPs即先用共沉淀法合成超顺磁氧化铁纳米粒(superparamagnetic oxide iron nanoparticles SPIO-NPs),依次用羧甲基壳聚糖和叶酸对SPIO-NPs表面进行共价修饰制备FA-OCMCS-SPIO-NPs.1.1共沉淀法合成超顺磁氧化铁纳米粒考察体系的PH值、温度、沉淀剂的种类和用量对SPIO-NPs粒径和组成的影响。用X-Ray衍射仪、激光散射粒度分析仪、透射电子显微镜、傅里叶红外光谱仪、超导电子干涉等对产物进行表征。1.2OCMCS对SPIO-NPs表面进行共价修饰合成以SPIO-NPs为核,OCMCS为“壳”的OCMCS-SPIO-NPs。为了对合成工艺进行优化,先单因素考察SPIO与OCMCS的比例对纳米粒粒径的影响,确定最佳的SPIO与OCMCS比例,然后,以纳米粒的粒径作为因变量,羧甲基壳聚糖的分子量(A)、浓度(B)、超声时间(C)及超声细胞粉碎仪的功率(D作为自变量,采用正交设计(L824)进行处方优化和工艺筛选。用透射电镜、激光散射粒度分析仪、电位测定仪、X-Ray衍射仪、傅立叶红外和超导电子干涉(superconducting quantum interference measurement device、SQUID)等对OCMCS-SPIO-NPs进行表征。MRI扫描测定弛豫率、邻二氮菲法测定铁含量。1.3利用OCMCS-SPIO-NPs的氨基基团与叶酸中羧基基团发生酰胺反应合成FA-OCMCS-SPIO-NPs,采用傅里叶红外扫描及X-Ray粉末衍射考察不同嫁接工艺对合成的FA-OCMCS-SPIO-NPs的红外图谱及Fe304晶型的影响,确定FA修饰OCMCS-SPIO-NPs的最佳工艺,按方法1.2对FA-OCMCS-SPIO-NPs进行表征；将FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和SPIO-NPs溶液4℃留样,观察溶液的形状,初步考察他们的溶液稳定性。2共沉淀法合成葡聚糖超顺磁氧化铁纳米粒(dextran-SPIO-NPs)并按方法1.2对合成的dextran-SPIO-NPs进行表征。3体外评价细胞毒性、叶酸受体肿瘤靶向性及抗吞噬细胞吞噬作用。3.1细胞毒性LO2细胞(正常肝细胞),叶酸受体高表达的KB细胞(人口腔上皮癌细胞)和叶酸受体不表达的A549细胞(肺小细胞腺癌细胞)常规传代培养后,以5×103/孔接种于96孔板上,培养24h后,分别与不同浓度的FA-OCMCS-SPIO-NPs, OCMCS-SPIO-NPs、dextran-SPIO-NPs和未包被的SPIO-NPs孵化24h,MTT法测定细胞毒性。3.2肿瘤靶向性3.2.1菲洛嗪法定量分析细胞内铁含量A549细胞常规培养于RPMI1640全培溶液中、Hela细胞(人宫颈癌细胞)和KB细胞常规传代培养于FFRPMI1640全培溶液中,以2.5×105/孔接种于24孔板,培养24h,PBS液洗涤三遍后,与不同浓度的FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMCS-SPIO-NPs孵化24后,菲洛嗪法测定细胞内铁含量。3.2.2普鲁士蓝染色A549细胞、Hela细胞和KB细胞常规传代培养后,以5×105/孔接种于6孔板上,孵化24h,分别加入0.4mgFe/ml的FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMCS-SPIO-NPs2ml24h后,普鲁士蓝染色,高倍镜下观察。3.3巨噬细胞摄取实验3.3.1菲洛嗪法细胞内铁含量常规培养RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞),以2.5×105/孔接种于24孔板,培养24h,PBS液洗三遍后,加入一系列不同浓度的FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、dextran-SPIO-NPs和未包被的SPIO-NPs,孵化24h后,PBS彻底清洗三遍,用0.5ml浓度为0.1M盐酸分散,菲洛嗪法测定细胞内铁含量。3.3.2普鲁士蓝染色常规培养RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞),以5×105/孔接种于6孔板上,孵化24h后,分别加入0.4mgFe/ml的上述纳米粒2ml与RAW264.7细胞孵化24h后,进行普鲁士蓝染色,倒置显微镜下观察。4.体内初步考察FA-OCMCS-SPIO-NPs的肿瘤靶向性及体内分布情况4.1体内肿瘤靶向性考察4.1.1实验动物：健康,SPF级裸鼠20只、鼠龄4-6周、雌雄各半,采用随机法将其分成两组：KB肿瘤细胞组(n=10)和A549肿瘤细胞组(n=10)。4.1.2细胞培养和肿瘤模型建立A549用细胞RPMI-1640全培常规培养、KB细胞用FFPRMI-1640全培常规传代培养,0.25%胰酶-EDTA消化,PBS液洗3遍后,无血清的培养基稀释制成每毫升含1.0×107/ml的细胞悬液,7号针头注射0.2 ml于裸鼠颈背部皮下。两周后,待瘤体最大直径≥1.0 cm时,选取已成功建立肿瘤模型的小鼠(16只,每组8只)进行动物实验。4.1.3 MRI扫描动物分组：将上述已成功荷瘤裸鼠(16只,每组8只)进一步随机分成四组：Ⅰ组,A549. OCMCS-SPIO-NPs(n=4);Ⅱ组,A549. FA-OCMCS-SPIO-NPs(n=4)；Ⅲ组,KB细胞、OCMCS-SPIO-NPs(n=4)；Ⅳ组,KB细胞、FA-OCMCS-SPIO-NPs组(n=4)。4.1.3.1 MRI扫描：采用西门子(Siemens Magnetom Vision Plus)1.5T,头部线圈,冠状面扫描,平扫后分别从尾静脉注射OCMCS-SPIO-NPs(5.54 mg Fe/ml)或FA-OCMCS-SPIO-NPs(5.62 mg Fe/ml)混悬液,剂量为0.25ml/只,给药3h后,MRI增强扫描。4.1.3.2图像分析T2WI图像测量平扫及增强3h后四组实验动物肿瘤感兴趣区(Region ofinterest, ROI)的信号强度(signal intense, SI)。测量时ROI放置在局部信号相对均匀,无明显伪影的区域,选取同一部位,测量三次,取其平均值并计算肿瘤信号强度下降百分比(percentage of SI loss, PSIL), PSIL=|(SIenhanced-SIunenhanced)|/SIunenhanced×100%,其中SIunenhanced、SIenhanced分别代表平扫、增强后感兴趣区的信号强度。4.1.4组织病理学检查将MRI扫描后的荷瘤小鼠脱臼处死,取其肿瘤组织于4%福尔马林溶液中固定24h,脱水、透明、包埋、切片分别进行H&E和普鲁士蓝染色,比较上述四组荷瘤小鼠肿瘤组织中SPIO的聚集情况说明FA-OCMCS-SPIO-NP的肿瘤靶向性。4.2初步评价FA-OCMCS-SPIO-NPs的体内分布SPF级昆明小鼠20只(购自南方医科大学实验动物中心),随机分成四组,每组各5只,Ⅰ组,OCMCS-SPIO-NPs;Ⅱ组,FA-OCMCS-SPIO-NPs;Ⅲ组,dextran-SPIO-NPs;Ⅳ组,空白。分别从尾静脉注射OCMCS-SPIO-NPs(5.44 mg Fe /ml)、FA-OCMCS-SPIO-NPs(5.62 mg Fe/ml)、dextran-SPIO-NPs(5.76mgFe/ml)和生理盐水各0.25m112h后,将小鼠脱臼处死,取其心、肝、脾、肺和肾于4%的福尔马林溶液中固定、透明、石蜡包埋、脱蜡至水行普鲁士蓝染色,高倍镜下观察。比较四组小鼠上述各组织中普鲁士蓝染色情况,说明SPIO-NPs在组织内的分布情况及体内抗吞噬作用。5统计分析：应用SPSS13.0软件包,采用正交实验的析因分析和配对t检验(Paired-Samples T Test)进行统计学处理,P<0.05统计学有显著性差异。结果1共沉淀法合成SPIO-NPs的单因素考察结果显示,铁盐溶液中pH值、反应温度及沉淀剂种类是影响SPIO-NPs合成的重要因素,制备超顺磁氧化铁纳米粒的最佳工艺是：铁溶液体系中Fe3+：Fe2+摩尔比为2：1,初始pH值为3.0,反应温度为30℃,沉淀剂为25%的氨水溶液、体积为48ml,消化温度为80℃。2正交实验析因及极差分析结果显示羧甲基壳聚糖的分子量、超声强度、羧甲基壳聚糖溶液的浓度对OCMCS-SPIO-NPs的粒径影响显著(FA=15.867、PA=0.028；FB=12.243、PB=0.040；FD=20.257、PD=0.02),而超声时间对纳米粒的粒径影响不显著(Fc=2.173,Pc=0.241),考虑到节约时间,最佳工艺处方是A1B1C1D2即羧甲基壳聚糖的浓度为2%、分子量为1-2万、超声时间为30分钟、强度为600W。3傅里叶红外及X-Ray衍射分析确定叶酸嫁接的最佳方案为：叶酸活性酯和OCMCS的比例为4：1,反应温度为50℃,在充氮、无氧、无水的二甲基亚砜溶液中反应。4 SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、FA-OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs的表征,结果如下：4.1透射电镜观察四种纳米粒均呈类圆形或椭圆形,大小均匀,表面平滑完整,SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、FA-OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs的平均粒径分别为：12.5±3.0nm、13.7±3.6nm,15.4±4.5nm和17.5±4.8nm。4.2激光粒度分析仪测定SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、FA-OCMCS-SPIO-NPs及dextran-SPIO-NPs的平均粒径和多分散系数分别为201.6nm和0.234、38.2nm和0.119、41.4和0.132、125.4nm和0.143。4.3磁性测定结果表明SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、FA-OCMCS-SPIO-NPs均具有超顺磁性,SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、FA-OCMCS-SPIO-NPs饱和磁矩分别为：98.0、71.4和69.6 emu/gFe4.4驰豫率测定结果：OCMCS-SPIO-NPs、FA-OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs的驰豫率分别为0.1685×106mol/s、0.1512×106mol/s和0.139×106mol/s,均高于0.062×106mol/s的最低标准,并且表明随着体系中SPIO的浓度增加,横向驰豫时间T2相应缩短。4.5 Zeta电位测定结果：FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs分别为-21.36±1.15mV、-27.88±0.73mV和-18.1±1.01mV。4.6优化处方工艺后制备的OCMCS-SPIO-NPs、FA-OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs溶液中铁含量分别为5.44mgFe/ml、5.62mgFe/ml和5.76mgFe/ml; SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和FA-OCMCS-SPIO-NPs干燥粉末内铁含量分别为663.89mg/g、615.61mg/g和601.40mg/g。4.7 X-Ray衍射法结果表明我们制备的SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和FA-OCMCS-SPIO-NPs粉末的晶型与标准Fe304粉末晶型一致,而且在该纳米粒的整个制备过程中,SPIO的晶型均未发生明显的改变。傅里叶红外结果说明OCMCS和FA是通过共价结合对SPIO进行修饰的,结果就是我们成功地合成FA-OCMCS-SPIO-NPs。5纳米粒的体外评价5.1体外细胞毒性结果FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs、dextran-SPIO-NPs和SPIO-NPs对L02、A549和KB细胞的细胞毒性实验结果表明随着培养液中SPIO的浓度增加,细胞活力均有下降的趋势(F=366.490,P=0.000),SPIO经过羧甲基壳聚糖和叶酸表面修饰后,对上述三种细胞的细胞毒性均显著下降(F=2256.204,P=0.000),多重比较显示FA-OCMCS-SPIO-NPs与未经叶酸修饰修饰的CMCS-SPIO对KB细胞的细胞毒性(P=0.000),但是FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMCS-SPIO-NPs对A549细胞的细胞毒性相差不显著(P=0.843)而且OCMCS-SPIO-NPs与dextran-SPIO-NPs的细胞毒性无显著性差异(P=0.122)；FA-OCMCS-SPIO-NPs与dextran-SPIO-NPs的细胞毒性无显著性差异(P=0.190)；5.2体外叶酸受体肿瘤靶向性评价菲洛嗪法测定细胞内的铁含量,统计分析表明对于叶酸受体高度表达的KB细或叶酸受体适度表达的Hela细胞,FA-OCMCS-SPIO-NPs组细胞内铁含量明显高于OCMCS-SPIO-NPs组(FKB=656.558,PKB=0.000; FHela=642.423, PHela=0.000)。FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs分别与KB细胞、Hela细胞和A549细胞孵化24h普鲁士蓝染色结果显示：在KB细胞FA-OCMCS-SPIO-NPs组的颜色明显深于OCMCS-SPIO-NPs组；Hela细胞,FA-OCMCS-SPIO-NPs组略深于OCMCS-SPIO-NPs组；A549细胞,FA-OCMCS-SPIO-NPs组和OCMCS-SPIO-NPs组普鲁士蓝染色后颜色变化不大,细胞内染色颜色很浅。5.3体外巨噬细胞摄取菲洛嗪法测定细胞内铁含量FA-OCMCS-SPIO-NPs组、OCMCS-SPIO-NPs组、dextran-SPIO-NPs组与未包被SPIO-NPs组RAW264.7细胞内铁含量差异显著((F=2302.289,P=0.000),结合普鲁士蓝结果显示RAW264.7与包被后SPIO-NPs孵化24h后细胞内铁含量远远低于未包被的SPIO-NPs组,而且FA-OCMCS-SPIO-NPs组与dextran-SPIO-NPs组RAW264.7细胞内铁含量,差异显著(P=0.007)。普鲁士蓝染色颜色由浅到深依次是空白,FA-OCMCS-SPIO-NPs,OCMCS-SPIO-NPs和uncoated-SPIO-NPs组。6体内肿瘤靶向性及逃避网状内皮系统吞噬作用6.1体内肿瘤靶向性评价6.1.1 MRI扫描说明体内靶向性MRI扫描结果表明荷A549细胞肿瘤小鼠尾静脉注射OCMCS-SPIO-NPs或FA-OCMCS-SPIO-NPs3h后,肿瘤部位T2加权信号与平扫信号无显著性差异。荷KB细胞肿瘤小鼠尾静脉注射OCMCS-SPIO-NPs3h后,肿瘤部位T2加权信号与平扫信号无明显下降,而注射FA-OCMCS-SPIO-NPs3h后,T2加权信号比平扫信号降低了27.23%,具有显著性差异(t=15.411,P=0.001)。6.1.2病理组织学检查HE染色和普鲁士蓝染色结果表明,只有尾静脉注射FA-OCMCS-SPIO-NPs的荷KB瘤小鼠肿瘤组织中有SPIO-NPs富集,普鲁士蓝染色阳性；而其他肿瘤组织中,均无SPIO-NPs富集,普鲁士蓝染色呈阴性。6.2体内分布的初步评价普鲁士蓝染色结果表明FA-OCMCS-SPIO-NPs组小鼠的心、肝、脾、肾、肺组织经普鲁士蓝染色后,所有组织普鲁士蓝染色为阴性,而在dextran-SPIO-NPs组,富含大量Kuffer细胞的肝、脾组织的细胞核和细胞质普鲁士蓝染呈阳性,在心、肺和肾普鲁士蓝染色阴性,OCMCS-SPIO-NPs组小鼠肝、脾有少量组织染成蓝色,浅于dextran-SPIO-NPs组。结论1我们成功地合成了具有“典型核壳”结构,内核粒径约为10nm,亲水性好,强超顺磁性,流体粒径<50nm的FA-OCMCS-SPIO-NPs。2体外细胞毒性结果表明利用羧甲基壳聚糖和叶酸对SPIO-NPs进行共价修饰能明显降低SPIO-NPs的细胞毒性。FA-OCMCS-SPIO-NPs组对叶酸受体高表达的KB细胞明显高于OCMCS-SPIO-NPs组,对于叶酸受体不表达的肿瘤细胞A549和LO2, FA-OCMCS-SPIO-NP和OCMCS-SPIO-NPs的细胞毒性无显著性差异。3体外靶向性结果表明所合成的FA-OCMCS-SPIO-NP具有很强的叶酸受体靶向性,细胞表面叶酸受体表达越高,细胞内铁含量越高,但是OCMCS-SPIO-NPs无叶酸受体肿瘤靶向性。4体外抗吞噬结果表明OCMCS的修饰可以明显降低RAW264.7细胞对超顺磁氧化铁纳米粒的摄取,而叶酸的进一步修饰对其吞噬作用影响很小。5体内实验表明FA-OCMCS-SPIO-NPs具有高的叶酸受体肿瘤靶向性和逃避网状内皮系统吞噬的能力。本研究的创新点生物相容性好、低毒、无免疫原性和价格低廉的羧甲基壳聚糖纳米粒为桥梁,将超顺磁氧化铁纳米粒与肿瘤靶向的配体--叶酸有机结合,制备具有肿瘤靶向和长循环作用的FA-OCMCS-SPIO-NPs。