论文部分内容阅读
目的:在世界范围内,乳腺癌的发病率和死亡率逐年递增,成为女性生命健康的重要危害。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)及细胞外信号调节激酶(Extracellular signal Regulated Kinase,ERK)介导的信号通路在乳腺癌细胞的增殖和转移过程中发挥了重要的调控作用。含Src同源结构域的非受体型酪氨酸磷酸酶-2(SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2)是罕见的具有磷酸酶活性的癌蛋白,与多种肿瘤的发生和发展密切相关。但SHP2在EGFR/ERK信号通路中的作用及对乳腺癌细胞增殖和转移能力的影响尚不明确。此外,SHP2蛋白同时含有磷酸酶结构域和酪氨酸磷酸化位点,SHP2在信号通路中发挥的作用是否依赖其磷酸酶活性也存争议。本研究的目的是:通过细胞学实验及构建相应动物模型明确SHP2及其磷酸酶活性对乳腺癌细胞在体外和体内的增殖、转移能力的影响。通过分析SHP2及其磷酸酶活性在EGFR/ERK信号通路中的调控作用,明确SHP2影响乳腺癌细胞增殖和转移的分子机制。方法:1.使用siRNA及shRNA在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549中构建SHP2降表达细胞系,通过Western blotting、细胞功能学实验及动物模型明确下调SHP2表达后细胞增殖、转移相关蛋白的表达变化,及对乳腺癌细胞在体外及体内增殖和转移能力的影响。2.通过核苷酸点突变构建可表达不同磷酸酶活性SHP2的突变体重组质粒。在SHP2降表达细胞系中,通过慢病毒转染导入重组质粒,构建不表达SHP2的阴性对照组(sh SHP2-p CDH)、表达野生型SHP2的对照组(sh SHP2-SHP2)、SHP2磷酸酶持续激活组(sh SHP2-N308D,sh SHP2-E76K)和SHP2磷酸酶持续失活组(sh SHP2-T468M)的稳定细胞系。3.通过Western blotting分析SHP2磷酸酶活性对乳腺癌细胞内ERK磷酸化水平的影响。4.通过Western blotting明确SHP2磷酸酶活性对细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1表达水平的影响;通过细胞功能学实验及构建小鼠皮下种植瘤增殖模型明确SHP2磷酸酶活性在体外及体内对细胞增殖能力的影响。5.通过Western blotting明确SHP2磷酸酶活性对ERK信号通路激活的影响;通过细胞功能学实验及构建小鼠尾静脉种植瘤转移模型明确SHP2磷酸酶活性在体外及体内对细胞侵袭、迁移能力的影响。6.通过Western blotting明确EGFR蛋白水平在SHP2通过磷酸酶激活ERK信号通路的中作用。7.通过Western blotting、免疫荧光实验明确SHP2磷酸酶活性对EGFR蛋白水平及EGFR蛋白在细胞内分布的影响。8.通过Western blotting、免疫荧光实验明确不同时间长度的EGF刺激对乳腺癌细胞EGFR蛋白水平、细胞内分布及ERK信号通路活化的影响。9.通过Western blotting、免疫荧光实验分析早期内吞体与EGFR在细胞内的分布特点及共定位;明确SHP2磷酸酶活性对EGFR的内吞降解、再循环至细胞膜定位的影响。结果:1.下调SHP2蛋白水平可引起MDA-MB-231和BT549细胞Cyclin D1、p-ERK蛋白水平降低,减弱了细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭迁移能力及小鼠皮下种植瘤生长速度(P<0.05)。2.在SHP2降表达细胞中导入含SHP2磷酸酶突变片段的重组质粒,细胞内的SHP2表达水平得以恢复。3.SHP2磷酸酶激活后乳腺癌细胞内ERK磷酸化水平明显升高,SHP2磷酸酶失活后ERK磷酸化水平明显减弱。4.SHP2磷酸酶激活使细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1表达水平上调,细胞增殖能力、克隆形成能力、DNA合成水平及小鼠皮下种植瘤生长速度明显增强(P<0.05)。5.SHP2磷酸酶激活使ERK的磷酸化水平上调,细胞侵袭、迁移能力及小鼠尾静脉种植瘤转移能力明显增强(P<0.05)。6.EGFR蛋白水平下调使SHP2磷酸酶活性对ERK信号通路的调控作用明显减弱。7.EGF刺激可激活乳腺癌细胞ERK信号通路;短时间EGF刺激可促进EGFR内吞降解,使EGFR蛋白水平下调。8.SHP2磷酸酶活性可抑制早期内吞体参与的EGFR内吞降解,促使EGFR再循环并定位至细胞膜分布。结论:本研究通过细胞学实验及动物模型证实了SHP2通过其磷酸酶活性激活ERK信号通路从而增强乳腺癌细胞在体外和体内的增殖、转移能力。进一步研究发现,SHP2通过其磷酸酶活性抑制了EGFR的内吞降解,使EGFR蛋白再循环并更多的定位于细胞膜分布,从而有助于持续激活EGFR/ERK信号通路,增强乳腺癌细胞的增殖和转移能力。