目的:　　澳洲茄边碱属于扶正抗癌方中龙葵的生物碱成分，文献报道扶正抗癌方治疗肺癌有良好的效果，随着相关研究的深入，对扶正抗癌方内的单味中药所含的单体成份的研究也逐渐开展。现有研究报道，龙葵以及澳洲茄边碱对于多种肿瘤均有较明显的抑制作用，但相关的作用机理报道较少。通过前期实验研究，我们发现澳洲茄边碱对肺癌细胞生长有良好的抑制作用。我们设置此课题，通过体内和体外实验进一步阐明澳洲茄边碱抑制非小细胞肺癌细胞生长可能的分子机制。　　方法:　　采用四甲基偶氮甲唑盐比色(MTT)方法检测澳洲茄边碱对肺癌细胞(A549、H1299、H1299、H1650、H1975)的生长的抑制作用，比较不同浓度澳洲茄边碱对肺癌A549、H1299细胞在24h，48h和72h的细胞活力的影响。采用流式细胞术(FlowCytometry，FCM)检测澳洲茄边碱作用48h后对A549和H1299肺癌细胞周期的影响。　　利用蛋白质免疫印迹法(Western Blot，WB)检测澳洲茄边碱(6.0μ M)不同时间点对A549和H1299肺癌细胞Akt、ERK等激酶蛋白磷酸化的表达的影响。利用蛋白质免疫印迹法检测不同浓度梯度澳洲茄边碱作用于A549和H1299肺癌细胞24小时后SP1、EP4、NF-κ B、DNMT1、c-Jun等蛋白表达情况。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测澳洲茄边碱(6.0μ M)对A549和H1299肺癌细胞EP4 mRNA表达水平的影响;采用双荧光素酶报告基因法检测澳洲茄边碱对A549和H1299肺癌细胞EP4启动子活性的影响;采用ERK抑制剂(PD98059)，观察澳洲茄边碱通过p-ERK对DNMT1蛋白表达的影响。采用外源性过表达（质粒转染）技术研究澳洲茄边碱作用后，观察相关蛋白表达的相互影响。　　动物实验采用A549-Luc细胞接种裸鼠腋下形成移植瘤模型。采用随机数字法分组，分为:空白对照组、澳洲茄边碱低剂量组(4mg/kg)、澳洲茄边碱高剂量组(8mg/kg)。隔天一次腹腔注射给药，用药30天。采用小动物活体成像技术观察比较，澳洲茄边碱低剂量和高剂量处理后裸鼠瘤体生物荧光信号与对照组的差异。观察比较处理前后瘤体体积、瘤体重量与对照组的变化。提取瘤体组织蛋白，采用Western Blot法观察高剂量澳洲茄边碱处理后裸鼠瘤体组织相关蛋白EP4、DNMT1、c-Jun、p-ERK与对照组比较蛋白表达的变化。　　结果:　　本研究分别从体外实验和体内实验证实了澳洲茄边碱对肺腺癌细胞生长的抑制作用，及其可能的分子机制。　　细胞实验结果显示，四甲基偶氮甲唑盐比色(MTT)方法证实澳洲茄边碱对多株肺癌细胞的生长具有抑制作用，同时证实澳洲茄边碱对肺癌A549和H1299细胞的生长抑制随着用药剂量的增加和作用时间的延长作用越明显，差异有统计学意义(p＜0.05)。流式细胞术检测证实澳洲茄边碱对肺腺癌A549、H1299细胞的细胞周期可阻滞在G0/G1期，差异有统计学意义(p＜0.05)。　　结果显示，澳洲茄边碱对Akt的磷酸化具有抑制作用，对SP1、NF-κ B(p65)、EP4蛋白的表达具有抑制作用，其随着剂量的增加和作用时间的延长作用越明显，差异有统计学意义(p＜0.05)。　　外源性过表达Akt可以阻滞澳洲茄边碱对SP1蛋白表达的抑制作用，差异有统计学意义(p＜0.05);外源性过表达SP1对澳洲茄边碱阻滞p-Akt蛋白表达无明显作用，差异不具有统计学意义(p＞0.05)。外源性过表达SP1可以阻滞澳洲茄边碱对p65蛋白表达的抑制作用，差异有统计学意义(p＜0.05);外源性过表达p65对澳洲茄边碱阻滞SP1蛋白表达无明显作用，差异不具有统计学意义(p＞0.05)。外源性过表达p65可以阻滞澳洲茄边碱对EP4蛋白表达的抑制作用，差异有统计学意义(p＜0.05)。外源性过表达EP4对澳洲茄边碱阻滞SP1、p65蛋白表达无明显作用，差异不具有统计学意义(p＞0.05)。过表达EP4对澳洲茄边碱阻滞p-Akt蛋白的表达具有阳性负反馈作用。同时，荧光定量PCR(qRT-PCR)法和双荧光素酶报告基因法证明澳洲茄边碱(6.0μM)可以降低A549和H1299肺癌细胞EP4 mRNA水平以及降低EP4启动子活性。　　结果显示，澳洲茄边碱对ERK的磷酸化具有促进作用，对DNMT1、c-Jun蛋白的表达具有抑制作用，其随着剂量的增加和作用时间的延长作用越明显，差异有统计学意义(p＜0.05)。　　外源性过表达EP4可以阻滞澳洲茄边碱对c-Jun蛋白表达的抑制作用，差异有统计学意义(p＜0.05);外源性过表达c-Jun对澳洲茄边碱阻滞EP4蛋白表达无明显作用，差异不具有统计学意义(p＞0.05)。外源性过表达EP4可以阻滞澳洲茄边碱对p-ERK蛋白表达的促进作用，差异有统计学意义(p＜0.05)。ERK抑制剂PD98059可以阻滞澳洲茄边碱对DNMT1蛋白表达的抑制作用，差异有统计学意义(p＜0.05)。外源性过表达DNMT1可以阻滞澳洲茄边碱对c-Jun蛋白表达的抑制作用，差异有统计学意义(p＜0.05)。外源性过表达c-Jun对澳洲茄边碱阻滞DNMT1蛋白表达无明显作用，差异不具有统计学意义(p＞0.05)。过表达c-Jun对澳洲茄边碱促进p-ERK蛋白的表达具有阳性负反馈作用。　　在动物实验中，澳洲茄边碱对移植瘤瘤体的体积增长具有明显的抑制作用。澳洲茄边碱低剂量组(4mg/kg)与高剂量组(8mg/kg)瘤体与对照组比较，移植瘤瘤体的生物荧光信号值都有明显降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。瘤体的重量偏轻，体积偏小，差异有统计学意义(p＜0.05)。同时，统计第15、20、30天，澳洲茄边碱高剂量组与低剂量组瘤体体积较对照明显偏小，差异具有统计学意义(p＜0.05)。在第20、30天，澳洲茄边碱高剂量组与澳洲茄边碱低剂量组比较，高剂量组瘤体体积有明显偏小，差异具有统计学意义(p＜0.05)。说明澳洲茄边碱对移植瘤瘤体的体积增长有抑制作用，且随着用药时间的延长与对照组的差异越明显。采用WesternBlot技术检测瘤体组织相关蛋白的表达显示体内实验结果与体外实验相关蛋白表达的变化趋势一致:与空白对照组相比，澳洲茄边碱高剂量组ERK的磷酸化水平升高，与空白对照组比较，差异具有统计学意义(p＜0.05)。澳洲茄边碱高剂量组可以降低EP4、c-Jun和DNMT1蛋白的表达水平，差异具有统计学意义(p＜0.05)。　　结论:　　本研究分别从体外实验和体内实验证实了澳洲茄边碱对肺腺癌细胞生长的抑制作用。体外实验结果证明，澳洲茄边碱对肺腺癌A549、H1299细胞的细胞活力具有抑制作用，且成剂量以及时间依赖关系，随着澳洲茄边碱剂量的增大以及给药时间的延长，澳洲茄边碱对肺腺癌A549、H1299细胞的细胞活力的抑制作用越明显。证明澳洲茄边碱对肺腺癌A549、H1299细胞的细胞周期的影响，对两株细胞的细胞周期均可阻滞在G0/G1期。证实澳洲茄边碱可能通过PI3k/Akt通路，抑制核转录因子SP1以及NF-κ B(p65)蛋白的表达，在转录与翻译水平抑制EP4的表达。通过对EP4蛋白表达的抑制，阻滞肺腺癌A549、H1299细胞增殖。实验结果提示EP4在澳洲茄边碱调节肺腺癌细胞增殖过程中起着重要作用。我们进一步对EP4的下游通路作深入研究，发现EP4可以通过对p-ERK的调节，进而影响DNMT1以及c-Jun的表达，同时证明c-Jun蛋白在澳洲茄边碱抑制肺腺癌A549、H1299细胞增殖中的重要作用。　　在动物实验中，澳洲茄边碱对移植瘤瘤体的体积增长具有明显的抑制作用。与对照组比较，澳洲茄边碱低剂量组与高剂量组瘤体的重量偏轻，体积偏小。同时，本次试验中澳洲茄边碱高剂量组与低剂量组比较，高剂量组抑制作用更明显。澳洲茄边碱对移植瘤瘤体的增殖随着用药时间的延长，与对照组差别越明显。　　在体外实验和体内实验中，澳洲茄边碱对肺腺癌细胞生长具有明显的抑制作用。本研究提示，EP4蛋白及其下游c-Jun蛋白在澳洲茄边碱抑制肺癌细胞生长的过程中起到重要作用，EP4蛋白及其下游c-Jun蛋白的表达的变化对肺癌细胞生长具有调节作用。　　综上所述，本研究体内实验与体外实验相关蛋白表达的变化结果一致，进一步肯定了澳洲茄边碱抑制肺癌细胞生长的作用。同时，进一步证实EP4和c-Jun在澳洲茄边碱抑制肺癌生长的过程中的重要作用，可能是治疗肺癌潜在的、具有前景的作用靶分子。