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背景与目的:肝癌的筛查性诊断主要依赖甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)及影像学检查,但效果不理想。30%~40%肝癌患者血清AFP呈阴性,小肝癌多为AFP阴性肝癌,且影像学诊断具有一定的困难。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)在肝癌组织呈特异性高表达,并可释放入血作为肝癌标志物,对肝癌的筛查性诊断可能具有良好的应用价值。目前一般采用免疫学方法测定血清GPC3水平,因其检测敏感性差而难以临床转化应用。适配子是生物分子的人工核酸配体,具有与靶标高特异性、高亲和力结合的特点,用于疾病诊断具有良好的应用前景。本课题组在前期研究中通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)成功筛选出一批GPC3适配子,并建立了基于荧光分析的适配子诊断应用技术。本研究将在前期工作基础上进一步评价这些适配子在肝癌诊断中的价值,以期为肝癌的诊断开辟新途径。方法:1.血清标本及临床资料收集:收集南昌大学第一附属医院2013~2014年就诊的原发性肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者及参加健康体检的正常人血清标本,-80℃保存备用。收集包括性别、年龄、肝功能、血清肿瘤标志物、影像学检查、病理检查等临床资料。2.GPC3适配子对肝癌诊断价值的初筛分析:人工合成20个GPC3适配子,将它们分别与肝癌、肝硬化血清标本各48例孵育,测定孵育前后的荧光值,通过受试者工作特征(Receiver operator characteristic,ROC)曲线评价单项荧光指标和多项荧光指标Logistic回归建模对肝癌的诊断价值,优选2个对肝癌诊断价值最佳的适配子进行后续研究。3.GPC3适配子诊断肝癌的实验条件优化:以不同的适配子用量和核酸染料用量组合成6种实验条件,在各种条件下将优选出的2个GPC3适配子分别与肝癌、肝硬化血清标本各32例孵育,测定孵育前后的荧光值,ROC曲线评价各条件下适配子对肝癌诊断的价值,以诊断价值最大者为最佳实验条件。4.适配子对肝癌诊断价值的评价:在最佳实验条件下,用优选出的2个适配子分别与小样本肝癌、肝硬化血清标本(各80例)孵育,测定孵育前后的荧光值,roc曲线分析单指标及多指标logistic回归分析建模对肝癌的诊断价值。将单指标roc曲线下面积(areaunderroccurve,auroc)达到0.8、多指标达0.9以上的适配子扩大样本量及样本类型进行分析(肝癌、肝硬化、肝炎和正常血清标本例数各100例以上)。roc曲线分析单项荧光指标、多项荧光指标logistic回归建模、适配子联合联合建模对肝癌的诊断价值,并计算适配子对肝癌的诊断效率(敏感度、特异度、准确度、预测值和似然比)。5.血清gpc3的elisa检测及诊断价值评价:以商业化的人gpc3的酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)检测试剂盒同步检测肝癌、肝硬化各80例血清标本中的gpc3浓度,评价其对肝癌诊断价值。6.血清肿瘤标志物对肝癌的诊断价值:收集各标本的血清afp、cea、ca125和ca19-9检测结果,roc曲线评价标志物单项和联合分析对肝癌的诊断价值。结果:1.gpc3适配子对肝癌诊断价值的初筛结果及适配子检测肝癌的最优条件:20个适配子中,9个适配子单项荧光指标诊断肝癌的最大auroc达0.8以上;16个适配子多项荧光指标联合分析诊断肝癌的auroc达0.9以上,其中ap-gpc3-13、ap-gpc3-27两个适配子的auroc分别为0.999与0.995,为优选适配子。两个优选适配子ap-gpc3-13、ap-gpc3-27在适配子及核酸染料用量分别在0.3pmol、2.5μl及0.5pmol、2.5μl条件下诊断肝癌的价值最大,为最佳条件。2.gpc3适配子对肝癌的诊断价值:小样本血清标本(肝癌、肝硬化各80例)分析上述2个优选适配子对肝癌诊断价值,最佳单指标auroc分别为0.852及0.884,优于afp;多指标联合分析auroc均为0.9以上,明显优于afp。扩大样本(肝癌、肝硬化、肝炎和正常血清分别为144、158、126、100例,肝硬化、慢性肝炎与正常合并为非肝癌组)评价2个适配子对肝癌的诊断价值,最佳单指标诊断肝癌与非肝癌的AUROC为0.75左右,多指标联合检测为0.9左右。2个适配子联合分析诊断肝癌与非肝癌的AUROC、敏感度、特异度、准确度均达0.9以上,优于单一适配子。在55例小肝癌(≤3cm)中,两个适配子的检测阳性率分别为63.6%和49.1%,高于AFP(43.6%);两者联合分析阳性率进一步提高,达74.5%。在68例AFP阴性肝癌,两个适配子的检测阳性率分别为70.6%和69.1%,两者联合分析达83.8%。3.ELISA检测血清GPC3对肝癌的诊断价值:肝癌组的血清GPC3水平为1.22±3.07ng/m L,肝硬化组的血清GPC3水平为1.36±3.35ng/m L,两组间差异无统计学意义,诊断肝癌的AUROC为0.575。4.肿瘤标志物对肝癌的诊断价值:在4组血清标本中,只有AFP对肝癌具有一定的诊断价值,诊断肝癌与非肝癌的AUROC为0.761,其他肿瘤标志物(CEA、CA125、CA199)无明显诊断价值,4种肿瘤标志物联合诊断肝癌的AUROC无明显增加。结论:1.GPC3适配子对肝癌具有良好的诊断价值,明显优于血清GPC3和AFP检测对肝癌的诊断价值。2.GPC3适配子对小肝癌和AFP阴性肝癌也有良好的诊断价值。3.适配子联合检测分析能进一步提高其对包括小肝癌和AFP阴性肝癌在内的肝癌诊断价值。