1. SIVH1N1和H3N2亚型重组HAl蛋白iELISA方法的建立将合成的SIV H1N1和H3N2的HA1分别插入原核表达载体pET28b(+),构建重组表达质粒pET28b(+)-H1HA1、pET28b(+)-H3HA1。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达,并用镍柱亲和层析法纯化蛋白。用猪流感阳性血清进行Western-blot,证明目的蛋白具有HAl蛋白抗原性。利用SIV HA1重组蛋白作包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪流感病毒抗体。结果表明本方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,适于大规模检测SIV血清抗体的流行病学调查。2.表达H1N1 HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析以质粒pET28b(+)-H1HA1为模板扩增猪流感病毒H1N1 HA1基因,并将其插入猪痘病毒载体pUSZ11中,构建了猪痘病毒转移载体pUSZ11/H1。将pUSZll/H1与猪痘病毒同源重组,获得表达猪流感H1N1 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H1。用SⅣH1N1阳性血清进行间接免疫荧光试验(IFA),证明该重组病毒在PK15细胞中可以表达HAl目的蛋白；用Western-blot检测,结果显示HA1蛋白能够正确表达,且抗原性良好。取45只BALB/c小鼠,随机分为3组,每组15只。第1组每只肌肉免疫rSPV/H1,剂量为0.2×1070 TCIDD50;第2组每只肌肉注射wtSPV0.2×107.0TCID5o,第3组每只肌肉注射PK15细胞裂解上清0.2 mL。21 d、35 d分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21、35、42 d采血测定ELISA抗体和中和抗体；在首次免疫后21、35、42d,测定脾淋巴细胞增殖反应；首次免疫后35d,测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。结果为：第1组小鼠在免疫后21d,可以检测到SIV H1N1 HA1特异的ELISA抗体和中和抗体,42d达到最高,抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。 21、35、42d,rSPV/H1免疫组小鼠淋巴细胞增殖指数(Stimulation Index, SI)显著高于wtSPV、PK15细胞免疫组(P<0.05)；35d时,rSPV/H1免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ(175.68 pg/ml)和IL-4(117.4 pg/ml)平均含量显著高于对照组(P<0.05)。取雌性Hartly豚鼠36只,随机分为6组,每组6只。第1、2组每只免疫rSPV/H1,剂量为每只0.4×107.0TCID50;第3、4组每只免疫wtSPV,剂量为0.4×107.0TCID50;第5、6组每只注射PK15细胞裂解上清0.4 mL。21 d加强免疫1次。首次免疫后28 d,测定外周血淋巴细胞培养上清中IFN-Y和IL-4的量。35 d测定中和抗体滴度。第35 d攻毒,第1、3、5组每只鼻腔注射0.2×105.0TCID50的HN1 SIV; 2、4、6组每只鼻腔注射0.2×105.0TCID50的H3N2 SIV。攻毒后观察7 d。对临床症状和肺大体病变进行评分。42 d将全部豚鼠安乐死,取肺组织处理、接种SPF鸡胚,HI试验检测流感病毒,同时观察肺组织病理变化。结果显示,免疫后28 d,1、2组淋巴细胞培养上清中SIV H1N1特异的的细胞因子IFN-γ(257.3 pg/ml)和IL-4 (208.26 pg/ml)的量显著高于对照组(P<0.05)。免疫35d, rSPV/Hl免疫组豚鼠血清中均能够检测到SⅣH1N1特异的中和抗体,而wtSPV、PK15免疫组血清对SIV H1N1没有中和活性。一免后35 d攻毒。攻毒后,免疫rSPV/H1的豚鼠无流感症状出现,而对照组豚鼠则表现有流感症状。rSPV/H1免疫组中只有用SIV H3N2攻击的2/6只豚鼠有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组豚鼠肺部都有范围大小不等的紫色、肉变区出现,病变范围从35%-75%。显微镜下见有严重的间质增生,有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏。免疫rSPV/H1的豚鼠只从用SIV H3N2攻击的1/6只中分离到SⅣ,而对照组全都分离到SⅣ。取30头6周龄SIV、PRRSV、PCV、SPV阴性猪,随机分6组,每组5头。第1组和第2组免疫rSPV/H1,第3、4组注射wtSPV,第5、6组注射PK15细胞裂解上清。在免疫后21d,检测H1N1的中和抗体和外周血淋巴细胞培养上清中IFN-Y和IL-4的量。在免疫后21d,所有猪攻毒。第1、3、5组每只鼻腔注入1×105.0 TCID50的HN1；2、4、6组每只鼻腔注入1×105.0 TCID50的H3N2。攻毒后连续5 d,观察临床表现,测体温、采鼻拭子。剖检时记录肺大体病变。检测肺组织SⅣ；同时取肺组织做病理切片。结果显示,免疫后21 d,1、2组淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ (247.48pg/ml)和IL-4(159.02 pg/ml)的量显著高于对照组(P<0.05). rSPV/Hl免疫组猪血清中均能够检测H1N1特异的中和抗体,wtSPV,PK15免疫组血清对SIV H1N1没有中和活性。攻毒后,免疫rSPV/H1的猪均无流感症状出现,而对照组则表现有流感症状。PK15和wtSPV组猪的鼻腔中一直持续分泌SIV,而重组毒免疫组在1、2天有2头检测到病毒,且分泌量明显低于对照组；其他猪未检测到病毒。rSPV/Hl免疫组猪中,用H3N2攻击的3/5头猪有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组猪肺部都有3%-9%的病变。免疫rSPV/Hl的猪只从用H3N2攻击的1/5号猪分离到H3N2,而对照组猪全都分离到H3N2。上述结果表明：本研究获得了SIV H1N1 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H1。 rSPV/H1能诱导小鼠产生显著的体液免疫和细胞免疫反应,不仅保护豚鼠和猪抵御同源SIV H1N1的攻击,还能部分抵御异型SIV H3N2的攻击。3.表达H3N2 HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析以质粒pET28b(+)-H3HA1为模板扩增H3N2 HA1基因,并将其插入猪痘病毒载体pUSZ11中,构建了猪痘病毒转移载体pUSZ11/H3。将pUSZ11/H3与猪痘病毒同源重组,获得表达H3N2 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3。用H3N2阳性血清进行间接免疫荧光试验(IFA),证明该重组病毒在PK15细胞中可以表达HA1目的蛋白；用Western-blot检测,结果显示HA1蛋白能够正确表达,且抗原性良好。取45只BALB/c小鼠,随机分为3组,每组15只。第1组每只肌肉免疫rSPV/H3,第2组每只肌肉注射wtSPV,第3组每只肌肉注射PK15细胞裂解上清。21 d、35 d分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21d、35d、42 d采血测定ELISA抗体和中和抗体；在首次免疫后21d、35d、42d,测定脾淋巴细胞增殖反应；首次免疫后35d,测定脾淋巴细胞培养上清中SIV H3N2特异的IFN-γ和IL-4的量。结果为：第1组小鼠在免疫后21d,可以检测到H3N2 HA1特异的ELISA抗体和中和抗体,42d达到最高,抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。21d、35d、42d,rSPV/H3免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖指数显著高于wtSPV、PK15细胞免疫组(P<0.05);35d时,rSPV/H3免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ(188.82pg/ml)和IL-4(133.57pg/ml)平均含量显著高于对照组(P<0.05)。取雌性Hartly豚鼠36只,随机分为6组,每组6只。第1、2组每只免疫rSPV/H3,第3、4组每只免疫wtSPV,第5、6组每只注射PK15细胞裂解上清。21d加强免疫1次。首次免疫后28 d,测定外周血淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。35 d测定中和抗体滴度。第35 d攻毒,第1、3、5组每只鼻腔注射SIV H3N2; 2、4、6组每只鼻腔注射SIVH1N1。攻毒后观察7 d。记录临床症状和肺大体病变。42 d将全部豚鼠安乐死,取肺组织处理、接种SPF鸡胚,HI试验检测流感病毒,同时取肺组织固定,做病理切片。结果显示,免疫后28 d,1、2组淋巴细胞培养上清中SIV H3N2特异的的细胞因子IFN-y(253.26pg/ml)和IL-4(191.88pg/ml)的量显著高于对照组(P<0.05)。免疫35d,rSPV/H3免疫组豚鼠血清中均能够检测到H3N2特异的中和抗体,wtSPV.PK15免疫组血清对H3N2没有中和活性。一免后35 d攻毒。攻毒后,免疫rSPV/H3的豚鼠无流感症状出现,而对照组豚鼠则表现有流鼻涕等流感症状。rSPV/H3免疫组中只有用H1N1攻击的有2只有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组豚鼠肺部都有大范围大小不等的紫色、肉变区出现,病变范围从35%-75%。显微镜下见有严重的间质增生,有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏。免疫rSPV/H3的豚鼠只从用H1N1攻击的1/6只的肺中分离到H1N1,而对照组全都分离到H1N1 SIV。取30头6周龄SIV(H3N2、H1N1)、PRRSV、PCV2、SPV阴性猪,随机分6组,每组5头。第1组和第2组免疫rSPV/H3,第3、4组注射wtSPV,第5、6组注射PK15细胞裂解上清。在免疫后21d,检测SIV的中和抗体和外周血淋巴细胞培养上清中H3N2特异的IFN-y和IL-4的量。在免疫后21d,所有猪攻毒。第1、3、5组每只鼻腔注入1×105.0TCID50的H3N2；2、4、6组每只鼻腔注入1×105.OTCID50的H1N1。攻毒后连续5 d,观察临床表现,测体温、采鼻拭子。剖检时记录肺大体病变。检测肺组织SIV；同时取肺组织做病理切片。结果显示,免疫后21 d,1、,2组淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ(264.10pg/ml)和IL-4(180.16pg/ml)的量显著高于对照组(P<0.05)。rSPV/H3免疫组猪血清中均能够检测到SⅣH3N2特异的中和抗体,wtSPV、PK15免疫组血清对SIV H3N2没有中和活性。攻毒后,免疫rSPV/H3的猪无流感症状出现,而对照组则表现有流感症状。PK15和wtSPV组猪的鼻腔中SⅣ分泌一直持续,而重组毒免疫组用异型SIV H1N1攻击的2/5头检出病毒,且分泌量明显低于对照组；其他猪未检测到病毒。rSPV/H3免疫组猪中,用H1N1攻击的有2头有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组猪肺部都有3%-9%的病变。免疫rSPV/H3的猪未分离到H1N1,而对照组猪全都分离到H1N1。上述结果表明：本研究获得了H3N2 HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3. rSPV/H3能诱导小鼠产生显著的体液免疫和细胞免疫反应,不仅保护豚鼠和猪抵御同源H3N2的攻击,还能部分抵御异型H1N1的攻击。4.串联表达H3和H1亚型的HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析本研究设计、合成基因H3-2A-H1(HA1 Of SIV H3N2,2A of FMDV and HAl gene Of SIV H1N1),将其插入猪痘病毒载体pUSZ11,获得pUSZ11/H3-2A-H1重组猪痘病毒转移载体。将pUSZ11/H3-2A-H1与猪痘病毒同源重组,获得表达猪流感H3N2和H1N1 HA1蛋白的重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1。用H3N2和H1N1阳性血清进行间接免疫荧光试验(IFA),证明该重组病毒在PK15细胞中可以表达H3N2和H1N1 HA1目的蛋白；用Western-blot检测,结果显示H3N2和H1N1 HA1蛋白能够正确表达,且抗原性良好。取45只BALB/c小鼠,随机分为3组,每组15只。第1组每只肌肉免疫rSPV/H3-2A-H1,剂量为0.2×107.0 TCID50;第2组每只肌肉注射wtSPV 0.2×107.0 TCID50,第3组每只肌肉注射PK15细胞裂解上清0.2 mL。21 d、35 d分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21d、35d、42 d采血测定ELISA抗体和中和抗体；在首次免疫后21d、35d、42d,测定脾淋巴细胞增殖反应；首次免疫后35d,测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。结果为：第1组小鼠在免疫后21d,可以检测到SIV H3N2和H1N1 HA1特异的ELISA抗体和中和抗体,42d达到最高,抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。21d、35d、42d,rSPV/H3-2A-H1免疫组小鼠淋巴细胞增殖指数显著高于wtSPV、PK15细胞免疫组(P<0.05);35d时,rSPV/H3-2A-H1免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4平均含量显著高于对照组(P<0.05)。取雌性Hartly豚鼠36只,随机分为6组,每组6只。第1、2组每只免疫rSPV/H3-2A-H1,剂量为每只0.4×107.0 TCID50;第3、4组每只免疫wtSPV,剂量为0.4×107.0 TCID50;第5、6组每只注射PK15细胞裂解上清0.4 mL。21 d加强免疫1次。首次免疫后28 d,测定外周血淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。35 d测定中和抗体滴度。第35 d攻毒,第1、3、5组每只鼻腔注射0.2×105.0 TCID50的H3N2 SIV; 2、4、6组每只鼻腔注射0.2×105.0TCID50的H1N1 SIV。攻毒后观察7 d。记录临床症状和肺大体病变。42 d将全部豚鼠安乐死,取肺组织处理、接种SPF鸡胚,HI试验检测流感病毒,同时取肺组织固定、做病理切片。结果为：免疫后28 d,1、2组淋巴细胞培养上清中SIV特异的的细胞因子IFN-γ和IL-4的量显著高于对照组(P<0.05)。免疫35d,rSPV/H3-2A-H1免疫组豚鼠血清中均能够检测到SIV H3N2和H1N1特异的中和抗体,wtSPV、PK15免疫组血清对SⅣ没有中和活性。一免后35 d攻毒。攻毒后,免疫rSPV/H3-2A-H1的豚鼠无流感症状出现,而对照组豚鼠则表现流鼻涕等流感症状。rSPV/H3-2A-H1免疫组无肉眼可见的肺部病理变化,而对照组豚鼠肺部都有范围大小不等的紫色、肉变区出现,病变范围从35%-75%。显微镜检查见有严重的间质增生,有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏。免疫rSPV/H3-2A-H1的豚鼠未分离到SⅣ,而对照组全都分离到SⅣ。取30头6周龄SIV、PRRSV、PCV、SPV阴性猪,随机分6组,每组5头。第1组和第2组免疫rSPV/H3-2A-H1,第3、4组注射wtSPV,第5、6组注射PK15细胞裂解上清。在免疫后21d,检测SIV H3N2和H1N1的中和抗体和外周血淋巴细胞培养上清中SIV特异的IFN-y和IL-4的量。在免疫后21d,所有猪攻毒。第1、3、5组每只鼻腔注入1×105.0 TCID50的SIV H3N2;2、4、6组每只鼻腔注入1×105.0TCID50的SIV H1N1。攻毒后连续5d,观察临床表现,测体温、采鼻拭子。剖检时记录肺大体病变。检测肺组织SIV；同时取肺组织做病理切片。结果显示,免疫后21d,1、2组淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-y和IL-4的量显著高于对照组(P<0.05)。rSPV/H3-2A-H1免疫组猪血清中均能够检测到H3N2和H1N1特异的中和抗体,wtSPV、PK15免疫组血清对SIV没有中和活性。攻毒后,免疫rSPV/H3-2A-H1的猪无流感症状出现,而对照组有流感症状。PK15和wtSPV组猪的鼻腔中有SIV分泌,重组毒免疫组未检测到病毒。rSPV/H3-2A-H1免疫组猪中,无肉眼可见病理变化,而所有对照组猪肺部都有3%-9%的病变。从免疫rSPV/ H3-2A-H1的猪肺未分离到SIV,而对照组猪全都分离到SIV。上述结果表明,本研究获得了串联表达H3N2和H1N1 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1。rSPV/H3-2A-H1能诱导小鼠产生显著的体液免疫和细胞免疫反应,能完全保护豚鼠和猪抵御同源H3N2和H1N1的攻击。