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研究背景：血管生成(Angiogenesis)是指在已有微血管基础上形成以毛细血管为主的新生血管系统,其主要步骤包括血管基底膜及细胞外基质的降解；内皮细胞的迁移、增殖：管状结构形成；平滑肌细胞和周细胞的附着等。血管生成在胚胎发育、女性子宫内膜血管重建及组织损伤修复等生理过程中起到重要作用。在某些病理条件下,如风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、银屑病及肿瘤等,血管生成也被证明起到关键作用。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一一类锌离子依赖性的蛋白内切酶,于1962年由Gross在蛙尾实验中首次发现,到目前为止已发现20余种。近年来发现,MMPs是除内皮细胞生长因子之外的另一类与血管生成密切相关的一个蛋白家族,能调控多种生理及病理条件下的血管生成。MMP14基因敲除能造成小鼠胚胎血管生成的重大缺陷。MMP13基因敲除能抑制小鼠皮肤创伤愈合时的血管生成。MMP7能诱导脐静脉内皮细胞的增殖,增加裸鼠异种异位移植肿瘤内的血管生成。一些基质金属蛋白酶也被证明在血管生成中起到抑制作用,如MMP12、MMP27。人们对MMPs调控血管生成的机制也做了大量的研究,目前认为,MMPs主要通过影响内皮细胞增殖、迁移以及促血管生成因子或血管生成抑制因子的表达及释放来调控体内、体外血管生成。基质金属蛋白酶8(MMP8),又称中性粒细胞胶原酶,最早在中性粒细胞中发现。随着研究的深入,人们发现内皮细胞、干细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等均表达MMP8。MMP8在多种细胞的增殖和迁移中起到重要作用。MMP8能促进小鼠中性粒细胞在角膜基质中的迁移,促进小鼠胚胎干细胞向内皮细胞表面的迁移,增加小鼠主动脉平滑肌细胞的增殖。但是有关MMP8在内皮细胞迁移、增殖及体内、体外血管生成过程中的作用尚无报道。动脉粥样硬化是冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的共同病理基础,已成为造成人类死亡的首位原因。越来越多的研究表明,斑块内血管生成与动脉粥样硬化的发展密切相关。斑块内新生血管可见于动脉粥样硬化病程中的各个时期,且病变越重,斑块内新生血管越丰富。这些新生血管一方面能增加斑块内巨噬细胞的浸润,促进红细胞来源的胆固醇在脂核中沉积,加重炎症反应,从而促进粥样斑块的快速进展：另一方面,斑块内新生血管缺乏细胞外基质和平滑肌细胞的支持,较正常血管脆性高,易导致斑块内出血、破裂,引发严重的急性临床事件如急性心肌梗死、脑卒中等,危及病人生命。已有研究表明,MMP8在人动脉粥样硬化斑块内有表达,且在快速进展的颈动脉粥样斑块中表达增加。又有研究证明,MMP8基因敲除能抑制小鼠动脉粥样硬化发展中的炎症反应,说明MMP8参与动脉粥样硬化的进展,但MMP8对动脉粥样硬化的作用是否与斑块内血管生成有关,亦无相关报道。目的：1.探讨MMP8在内皮细胞增殖、迁移及体外血管生成中的作用及相关分子机制。2.利用动物模型探讨MMP8在体内血管生成中的作用。3.利用apoE/MMP8(?)基因敲除小鼠(apoE-/-/MMP8-/-)和对照组小鼠(apoE-/-/MMP8-)小鼠建立动脉粥样硬化动物模型,观察MMP8对动脉粥样硬化及斑块内血管生成的影响。方法：1.利用编码MMP8shRNA(short hairpin RNA,shRNA)的病毒体和编码非靶向shRNA(Nontarget shRNA)的病毒载体分别感染人脐静脉内皮细胞(Human ublilical vein endothelial cells,HUVECs)。完成药物筛选后,以MMP8shRNA组HUVECs和Nontarget shRNA组HUVECs为研究对象,用罗氏公司Brdu检测试剂盒和Ki67免疫荧光染色检测两组内皮细胞的增殖；用划痕实验(Wound seratch assay)测量两组内皮细胞的迁移距离；用体外基质胶成管实验(In-vitro Matrigel tube formatino assay)计算两组内皮细胞的成管数、成竹长度及分支点数。提取总蛋白,用Western Blot检测两组内皮细胞MMIP8、CD31、β-catenin的表达。提取核蛋白和胞浆蛋白,用Western blot检测两组内皮细胞β-catenin在胞核和胞浆的水平。利用细胞免疫荧光染色,观察两组内皮细胞β-catenin在胞核和胞浆的分布；用实时定量PCR检测两组内皮细胞β-catenin目的基因的表达情况。使用血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)和血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)分别刺激两组内皮细胞,Western blot检测两组内皮细胞CD31的表达。2.建立两套基质胶栓(Matrigel plug)血管生成实验动物模型,评估MMP8在体内对血管生成的影响。在第一套基质胶栓实验中,将MMP8shRNA组和Nontarget shRNA组脐静脉内皮细胞用PKH26红色荧光物质标记,然后分别与基质胶混匀,并注射于两组apoE-/-/MMP8-/-小鼠皮下。在荧光显微镜下计数两组基质胶栓切片中PKH26荧光标记细胞,以判断外源性脐静脉内皮细胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠体内的存活情况；用HE染色,计算基质胶栓中微血管密度及毛细血管密度,以评估两组脐静脉内皮细胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠体内的血管生成情况。在第二套基质胶栓实验中,将血管内皮生长因子165(Vascular Endothelial Growth Factor165,VEGF165)与基质胶混合,然后分别注射于apoE-/-/MMP8+/+组小鼠和apoE-/-/MMP8-/-组小鼠皮下。用免疫双标荧光染色,计数基质胶栓中CD144阳性细胞和Ki67/CD144双阳性细胞,以评估两组小鼠的血管内皮细胞在基质胶栓中迁移和增殖情况。通过HE染色,计算基质胶栓中的微血管密度,以评估两组小鼠的血管内皮细胞在基质胶栓中的血管生成情况。3.分别留取人胸主动脉瘤和冠状动脉的标本,制作成石蜡切片,利用免疫组织化学染色观察MMP8在两组临床标本粥样斑块内微血管的表达情况。分别给予apoE-/-/MMP8+/+组小鼠和apoE-/-/MMP8-/-组小鼠高脂饮食12周,建立小鼠动脉粥样硬化动脉模型。使用油红0染色,测量两组小鼠主动脉根部粥样斑块面积及主动脉纵剖面粥样斑块面积指数,以探讨MMP8在小鼠动脉粥样硬化发展中的作用；通过免疫组织化学染色,测量两组小鼠动脉粥样斑块内CD31、CD144阳性染色面积和阳性颗粒数,并计算阳性染色面积比例(阳性染色面积/粥样斑块面积)和阳性颗粒密度(阳性颗粒数/粥样斑块面积),以评价MMP8基因敲除对小鼠动脉粥样斑块内血管生成的影响。结果：1.未进行病毒感染的内皮细胞在嘌呤霉素作用24h后全部死亡。MMP8shRNA组内皮细胞和Nontarge t shRNA组内皮细胞在嘌呤霉素作用24h后仍有大量细胞存活。药物筛选10天后,两组细胞均表现良好的生长状态。MMP8shRNA组内皮细胞的增殖、迁移、成管数、成管长度及分支点数均较Nontarget shRNA组显著减弱(P<0.05)。Western blot结果显示,MMP8shRNA组内皮细胞总蛋白中MMP8、CD31的表达量较Nontarget shRNA组显著下降(P<0.05)；MMP8shRNA组内皮细胞β-catenin的表达较Nontarget shRNA组虽有轻度下降,但无统计学意义(P>0.05)。提取两组内皮细胞核蛋白及胞浆蛋白,Western blot结果显示MMP8shRNA组内皮细胞核内β-catenin的水平较Nontarget shRNA组明显减少(P<0.05)。细胞免疫荧光结果也进一步证实,MMP8表达下调能减少β-catenin在内皮细胞核内的分布。实时定量PCR结果显示MMP8shRNA组内皮细胞β-catenin目标基因TCF1B.TCF1E.FZD7和CCNDI的mRNA水平均较Nontarget shRNA组明显降低(P<0.05)。10nM血管紧张素作用6h、16h、24h后,两组内皮细胞CD31的表达在以上时间点均显著上调(P<0.05)。10nM血管紧张素1作用24h后,Nontarget shRNA组内皮细胞CD31的表达显著上调(P<0.05),而MMP8shRNA组内皮细胞CD31的表达无显著变化(P>0.05)。2.在第一套基质胶栓实验中,两组基质胶栓中PKH26阳性细胞数均达到总细胞数的90%以上,说明两组外源性脐静脉内皮细胞在小鼠体内可以存活,且存活率相对较高。MMP8shRNA(?)脐静脉内皮细胞在apoE/MMP8小鼠体内基质胶栓中形成的微血管密度和毛细血管密度均较Nontarget shRNA组脐静脉内皮细胞显著减少(P<0.05)。在第二套基质胶检实验中,apoE/MMP8小鼠基质胶栓中微血管密度、CD144阳性细胞数、内皮细胞的Ki67阳性比例均较apoE/MMP8小鼠组明显减少(P<0.05)。3.免疫组织化学染色结果显示人胸主动脉瘤和冠状动脉的粥样斑块区含有较多微血管,且微血管的管壁和管腔面均表达大量MMP8。apoE/MMP8和apoE/MMP8两组小鼠接受高脂饮食12周后,油红0染色结果显示apoE/MMP8小鼠主动脉根部粥样斑块面积和主动脉纵剖面粥斑块面积指数均较apoE/MMP8小鼠明显减少(P<0.05)。免疫组织化学染色显示apoE/MMP8小鼠粥样斑块内CD31、CD144的阳性染色面积比例和阳性颗粒密度均较apoE-/-/MMP8+/+组小鼠显著减少(P<0.05)。结论：1.MMP8表达下调能抑制脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及体外血管生成,MMP8的这种作用与Ang Ⅱ/CD31/β-catenin传导通路相关。2.MMP8表达下调能抑制脐静脉内皮细胞在小鼠体内基质胶栓中的血管生成。MMP8基因敲除能抑制小鼠血管内皮细胞在基质胶栓中的增殖、迁移及血管生成。3.MMP8基因敲除能抑制小鼠动脉粥样硬化的发展及斑块内血管生成。本研究从血管生成的体外模型(增殖、迁移、体外成管实验)、体内模型(基质胶栓实验)、整体模型(动脉粥样斑块内血管生成)等三个水平首次表明MMP8在血管生成中起到重要作用。