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福司曲星(Fostriecin, FST)是由链霉菌Streptomyces pulveraceus产生的一种磷酸酯类聚酮化合物,具有良好的抗肿瘤活性。FST的生物合成是由Ⅰ型聚酮合酶催化形成,其后经过一系列后修饰加工反应,如：羟基化、磷酸化等。目前,对FST的研究主要针对其生物活性及化学合成方面。不同链霉菌遗传转化体系建立的难易程度不同,FST产生菌的遗传转化体系较难建立,至今未见FST产生菌遗传转化体系和生物合成机制的相关报道。本研究建立并优化了FST产生菌S. pulveraceus的遗传转化体系；通过基因阻断失活,确定了FST生物合成后修饰基因的功能；初步确定了FST生物合成的PKS后修饰途径。具体研究结果及结论如下：(1)利用接合转移方法建立并优化了FST产生菌S. pulveraceus的遗传转化体系。最适宜的转化条件为：以孢子悬液作为受体菌,50℃热激10min,涂布于添加终浓度为5%甘氨酸的MS培养基,培养18h后,用终浓度为20μg/mL的阿伯拉霉素和25μg/mL的萘啶酮酸覆盖。(2)对Red/ET重组系统的电转体系进行优化,提高了同源重组效率。具体的参数为：电转时加入500ng外源线性DNA,制备感受态细胞时大肠杆菌培养至OD600值为0.4～0.6,感受态细胞的终浓度为0.7×107个/μL,添加的L-阿拉伯糖终浓度为20mmol/L,诱导3h。(3)根据FST基因簇上与其生物合成相关的基因序列进行BLAST同源比对分析,发现FST生物合成基因簇含有5个主要后修饰基因,被命名为fosG、fosJ、fosK、fosH和fosM。为了研究它们各自的功能,通过基因阻断试验对基因进行失活。与野生型菌株相比,fosG阻断变株不再产化合物PD113271,以FST为主要产物；fosJ阻断变株产生五种新衍生物(1-5)；.fosH阻断变株产生两种新衍生物(6,7)；fosK阻断变株产生两种新衍生物(8,PD113270)；而fosM基因缺失突变株只产生一种新衍生物(9)。经质谱和核磁对新衍生物的结构进行解析,初步证实了这5个后修饰基因的功能。fosG、 fosJ、fosK编码细胞色素P450单氧化酶,属于羟化酶,分别修饰FST C-4、C-8及C-18位的羟基化；FosH属于磷酸激酶家族成员,参与FST C-9位的磷酸化；fosM基因负责脱去C-3位丙二酸酯形成FST C2, C3位之间的不饱和双键。(4)通过基因互补试验,确定基因缺失突变株的代谢产物不是由其它因素影响的。以pSET153-tsr为出发质粒,连入目的基因构建基因回复载体,分别转入相应的基因阻断突变株中,得到回复菌株。对其进行摇瓶发酵,HPLC分析显示：基因在其阻断变株中获得表达,fosJ～fosM回复菌株重新合成FST, fosG回复菌株重新积累到化合物PD113271。(5)多数聚酮化合物的结构中包含一个或多个双键,这些双键是由PKS模块中酮还原酶-脱水酶(KR-DH)双结构域催化形成,但FST PKS最后一个模块缺少DH结构域,无法形成内酯环的不饱和双键。通过对fosM基因功能的研究,发现该不饱和双键的形成不依赖于PKS模块脱水酶(DH)结构域,由后修饰基因fosM完成。FST生物合成的整个PKS后修饰过程均伴随着C-3位丙二酸酯结构进行,只有当FosK催化形成C-18位羟基后,FosM才发挥功能作为FST合成的最后一步脱去丙二酸形成不饱和内酯。(6)根据5个后修饰基因阻断试验得到的一系列衍生物结构分析,初步确定了FST生物合成的PKS后修饰途径。带有丙二酸酯结构的化合物4经FosJ羟化,加载C-8位羟基,形成化合物6。再先后经FosH和FosK作用,在C-9位进行磷酸化,C-18位进行羟基化,形成化合物8和9。FosM最后发挥作用,脱去丙二酸,形成C2-C3位间的双键,完成FST的生物合成。FosG是在FST合成后才开始执行它的功能,形成C-4位带羟基的FST即化合物PD113271。