螺旋藻蓝细菌光敏色素SPI1085g2的克隆、重组表达及荧光功能研究

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重金属污染对人类健康及生态环境的危害日益严重,建立灵敏且选择性强的重金属检测方法十分重要。荧光蛋白在生物传感器、生物学标记、荧光成像等方面具有重要的应用价值,近几年从蓝细菌光敏色素中发展的荧光蛋白由于分子量小,荧光量子产率高及光谱多样性受到广泛的关注。本研究通过PCR技术从盐泽螺旋藻S.subsalsa FACHB351中扩增出蓝细菌光敏色素SPI1085g2编码基因SPI1085g2,采用分子克隆技术构建至表达载体上,得到的表达质粒p ETDuet-SPI1085g2,并将其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)体内与藻红胆素PEB进行重组共表达,合成了荧光色素蛋白PEB-SPI1085g2。该蛋白在523 nm处展现最大吸收峰、555nm处展现最大荧光发射峰,其荧光量子产率接近1,说明该蛋白可作为优良的荧光生物材料。为了解PEB-SPI1085g2的物理化学特征,本论文研究了其在p H、温度、光漂白以及盐分条件影响下的荧光稳定性能。研究结果表明:在中性及碱性条件下(p H≥6),PEB-SPI1085g2有较好的稳定性,在强酸性条件下(p H≤4)发生荧光猝灭,其p H稳定性明显好于YFP(黄色荧光蛋白);25℃至60℃范围内,PEB-SPI1085g2荧光强度基本不受影响,当温度高于60℃时,荧光强度明显减弱,温度达到90℃时基本无荧光;用蓝光(450nm)对样品进行光漂白,初期(前800 s)PEB-SPI1085g2的荧光约损失了20%,而后(1800s内)荧光强度趋于不变;在盐浓度为5 mol/L时,PEB-SPI1085g2荧光强度仍然维持在80%左右,与YFP在为盐浓度2 mol/L时已降低为原始值的20%相比,证实PEB-SPI1085g2具有高度的盐稳定性,其生物传感器技术能适用于高盐环境中。为发展重金属检测的新型生物传感器,本论文研究了PEB-SPI1085g2对金属离子的响应能力。研究表明PEB-SPI1085g2在10μmol/L以下对Cu2+有特异性响应,其Cu2+浓度和其荧光强度表现出剂量-效应关系,这为发展基于PEB-SPI1085g2的Cu2+生物传感器奠定基础。同时,本研究通过将SPI1085g2和绿色荧光蛋白(GFP)或蓝细菌光敏色素(All2699g1)进行融合,并在大肠杆菌中用PEB色素化,构建了融合色素蛋白PEB-GFP::GGS::SPI1085g2和PEB-All2699g1::GGS::SPI1085g2。结果表明,PEB-GFP::GGS::SPI1085g2展现398、520nm的最大吸收值和509、544 nm的最大荧光发射值;PEB-All2699g1::GGS::SPI1085g2展现展现523、576 nm的最大吸收值和555、590 nm的最大荧光发射值。这为进一步构建基于色素荧光蛋白SPI1085g2的荧光共振能量转移对提供依据,也为重金属检测的新型生物传感器研制奠定基础。
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