研究背景:结直肠癌(CRC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,目前我国结直肠癌患者发现多属晚期,五年生存率低,而结直肠进展期腺瘤(CRA)是结直肠癌最重要的癌前病变。大量数据显示,TNM I期结直肠癌可通过外科手术治愈,II期率的五年生存率为78%,III期和IV期的五年生存率不足40%,探索TNM I、II期CRC和CRA的最佳筛查方法具有较高的临床意义。最近研究发现,粪便脱落细胞mi R-135b在结直肠癌、结直肠腺瘤的表达量高于正常对照,差异具有统计学意义,但诊断意义较低,可能与当前采用的粪便脱落细胞富集方法导致的细胞富集率低有关。我们首次采用了h NOK/h Sef单克隆抗体-叶酸磁珠法,富集清肠液中的肠道上皮脱落细胞,并评估该方法的富集效率。同时以TNM I、II期CRC、进展期腺瘤和正常对照为研究对象,评估粪便脱落细胞mi R-135b诊断结直肠进展期腺瘤和TNM I、II期癌的诊断意义及其与临床病理特点的相关性。目的:1.验证mi R-135b在结直肠癌癌组织与癌旁正常粘膜组织的表达量差异,及其与TNM分期的关系。2.评估hNOK/hSef单克隆抗体-叶酸纳米磁珠法富集粪便脱落细胞的效率。3.评估粪便脱落细胞mi R-135b诊断TNM I、II期CRC和CRA的诊断意义及其与临床病理特点的相关性。方法:1.抽取北京军区总医院消化内窥镜室2014年9月至2015年12月期间行结肠镜检查并经病理学确诊的CRC患者18例,不伴有其他恶性肿瘤,未进行手术、放化疗等任何治疗。在行结肠镜检查时留取癌组织及癌旁正常黏膜组织,离体后立刻放入盛有RNALater RNA stablization reagent的冻存管中,置于﹣80℃冰箱中保存。提取结直肠癌癌组织、癌旁正常组织的总RNA,电泳检测提取到的总RNA完整性,实时定量PCR(real-time PCR,q RT-PCR)测定其中mi R-135b的相对表达量。验证mi R-135b在结直肠癌患者癌组织表达量与癌旁正常粘膜组织的差异,及其与TNM分期的关系。2.抽取北京军区总医院消化内窥镜室2014年9月至2015年12月期间行结肠镜检查的患者102例,其中TNM I、II期结直肠癌患者52例;进展期腺瘤患者34例(腺瘤直径大于1cm);正常人16例作为对照。以上病例均经病理学诊断证实,不伴有其他恶性肿瘤,患者未进行手术、放化疗等任何治疗。收集患者口服导泻药后的清肠液送至实验室,采用h NOK/h Sef单克隆抗体-叶酸磁珠法富集粪便脱落细胞,制得细胞悬液,分为2份。一份用于细胞计数和提取DNA后通过q RT-PCR检测细胞内参基因(β-actin)信号,评价富集细胞的效率;另一份用于提取RNA,q RT-PCR测定其中mi R-135b的相对表达量。评估粪便脱落细胞mi R-135b表达量对TNM I、II期CRC、CRA和正常对照的诊断意义及其与临床病理特点的相关性。结果:1.所有样本提取的总RNA OD值在1.8-2.0之间,说明样本未受污染,电泳图可见28s、18s、5s三条带,说明RNA具有较高的完整性。2.miR-135b在CRC患者癌组织中的表达高于癌旁正常组织(P=0.021),且与TNM分期进展呈正相关。3.粪便脱落细胞悬液反应前平均细胞计数为1.0×106/ml,反应后平均细胞计数为0.97×106/ml,所有样本内参基因(β-actin)信号均为阳性。4.粪便脱落细胞mi R-135b在进展期腺瘤的表达水平高于正常对照(P=0.029);在TNM I、II期结直肠癌粪便脱落细胞中的表达水平高于正常对照(P=0.038);TNM I、II期的表达水平无明显区别(P=0.290)。根据ROC曲线结果分析,截断点(cut off值)=1.63时,粪便脱落细胞mi R-135b在进展期腺瘤、TNM I、II期结直肠癌的敏感性分别为76.92%、78.24%,在正常对照的特异性为87.50%,AUC分别为0.70(P=0.02)、0.80(P<0.001)。5.早期结直肠癌患者粪便脱落细胞中miR-135b的表达与患者年龄、性别、肿瘤分化水平、TNM分期和所在部位无关。结论:1.miR-135b在CRC患者癌组织中的表达量高于癌旁组织,且与TNM分期进展呈正相关。2.h NOK/h Sef单克隆抗体-叶酸纳米磁珠法富集粪便中脱落肠道上皮细胞具有较高的效率。3.粪便脱落细胞mi R-135b具有较好的TNM I、II期结直肠癌和进展期腺瘤诊断价值,其表达水平与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度无关,TNM I和II期的表达量无明显差异。