斜带石斑鱼P450芳香化酶基因启动子活性分析

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芳香化酶—细胞色素P450芳香化酶(cyp19基因编码)和NADPH细胞色素P450还原酶组成的酶的复合物,是雄激素转变为雌激素过程中的关键酶。在大多数硬骨鱼中存在着两种cyp19基因,编码了两种不同结构和功能的芳香化酶亚型,在性别分化、生殖周期的调控、雄性鱼类的繁殖行为等方面有重要的作用。目前对于鱼类cyp19基因的调控机制还不清楚,本文主要是研究斜带石斑鱼cyp19基因启动子的活性及调控方面。 用rVista在线软件对实验室已获得的斜带石斑鱼启动子的保守性进行pairwise比对分析,结果表明斜带石斑鱼cyp19ala和cyp19alb基因的近端启动子在硬骨鱼类中具有较高的保守性。在cyp19alb近端启动子上都具有RFX,STATI,ERE结合位点;而在cyp19ala启动子上则具有FOXO家族结合位点。 本文通过构建斜带石斑鱼cyp19alb和cyp19ala启动子系列缺失的荧光素酶报道质粒,分别转染C6(大鼠神经胶质瘤细胞)和TM4(小鼠精巢支持细胞)细胞,分析了启动子的转录活性。结果表明:在TM4细胞中,cyp19ala基因启动子—246/-112区域对其活性具有明显的诱导作用,—541/—246区域对其活性有明显的抑制作用;在C6细胞中,cyp19alb基因启动子—289/—202区域对其活性具有明显的诱导作用,—921/—378区域对其活性具有明显的抑制作用。 本文对cyp19ala启动子上保守的FTZ—F1和SRY位点功能进行了探讨。突变近端启动子上的FTZ—F1位点明显降低启动子活性,而突变SRY位点明显提高启动子活性,说明FTZ—F1位点对cyp19ala启动子活性有正调控作用,而SRY位点有负调控作用。 为了分析实验室已克隆到的斜带石斑鱼FTZ—F1和Sox11b是否能调节cyp19ala的转录,本文将FTZ—F1和Sox11b的编码区克隆到pcDNA3.0表达载体中,然后同cyp19ala启动子报道质粒共转染。结果表明:FTZ—F1在TM4细胞和COS—7细胞中对启动子没有诱导作用,提示目前我们克隆到的FTZ—F1并不是生理意义上cyp19ala基因的转录调控因子,而Sox11b对cyp19ala的表达也没有调控作用。 此外,在斜带石斑鱼垂体中还克隆到FTZ—F1的多种剪接形式,这些剪接形式的具体功能有待进一步研究。
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