根癌农杆菌属于革兰氏阴性菌,能够将自身Ti质粒上的一段T-DNA序列转移并整合到植物基因组中,从而引起多数双子叶植物产生冠瘿瘤。在自然环境中,根癌农杆菌通常位于植物的根际周围,趋化是其与宿主相互作用的重要的第一个过程。只有根癌农杆菌对宿主释放的化学信号进行趋化响应,才能与植物宿主细胞发生接触,侵染和致瘤的过程。趋化是能动细菌的一种重要的适应性行为,它能促使细菌向引诱物方向运动或远离排斥物。这些化学效应物主要被甲基受体趋化蛋白(MCP)所感知。根癌农杆菌C58的基因组中有20个编码MCP同源蛋白的基因。只有atu0514基因位于编码根癌农杆菌趋化系统的操纵子内部。与大多数细菌中的MCP不同,atu0514编码的MCP没有胞外结构域,并且由配体结构域protoglobin、HAMP和胞质信号域MA组成。因此,需要研究atu0514基因编码蛋白的功能和定位。本实验以野生型的根癌农杆菌C58为实验材料,通过无标记反向筛选的方法,获得atu0514基因缺失株,并通过质粒回补,得到回补菌株。通过对野生型菌株、atu0514突变株和回补株的生长曲线测定,发现缺失atu0514基因不影响根癌农杆菌的生长;利用游动平板法测定atu0514基因缺失对根癌农杆菌趋化响应的影响,发现缺失atu0514基因会减弱根癌农杆菌的趋化性,但趋化性没有完全消失;通过毛细管法测定atu0514突变株对单一物质的趋化响应,实验结果表明,野生型C58对10-6 M葡萄糖、10-3 M銅氨酸、10-3M精氨酸、10-3M柠檬酸均具有趋化性,而缺失atu0514基因会削弱根癌农杆菌对这些物质的趋化响应,但是趋化并没有完全消失,说明atu0514基因编码蛋白可能与其他的MCP相互作用,共同响应葡萄糖、缬氨酸、精氨酸、柠檬酸等信号物质;通过细菌双杂交实验和半乳糖苷酶酶活测定验证atu0514编码蛋白的MA结构域能够和偶联蛋白CheW1、CheW2相互作用。为研究Atu0514的定位,首先需要将EGFP绿色荧光蛋白融合到Atu0514的C端,构建Atu0514-EGFP荧光融合蛋白。通过荧光显微镜观察发现,Atu0514定位在细胞的一端;在缺失CheW1和CheW2的突变体中发现,Atu0514依然定位在一端,不受CheW蛋白的影响;由于化学受体蛋白Atu0514具有三个结构域,配体结构域Protoglobin,信号转导域HAMP和胞质信号结构域MA,而MA结构域中包含能够和CheW相互作用的高度保守结构域HCD,甲基化结构域K1和R1,所以我们依据结构域构建了一系列含有不同长度截短的atu0514-egfp的表达载体,来初步分析影响Atu0514蛋白细胞定位的结构域。实验结果发现,缺失胞质信号域MA会影响Atu0514的定位,不再定位在一端,而是弥散在细胞中,进一步对MA结构域的各个部分深入分析发现,一起缺失掉MA结构域中的甲基化结构域R1和高度保守结构域HCD时,Atu0514蛋白同样不定位在细胞一端,弥散在细胞中,说明Atu0514蛋白通过MA结构域与其他跨膜甲基受体趋化蛋白互作,从而使Atu0514蛋白定位在细胞一端。atu0514编码蛋白具有3个结构域,MA结构域是大多数甲基受体趋化蛋白具有的胞质信号域,从分子水平分析atu0514基因对趋化的影响,从而构建一系列点突变菌株,并通过游动平板验证发现,第390位天冬酰胺是关键的氨基酸位点,突变后会影响根癌农杆菌的趋化响应。通过对Atu0514蛋白功能和细胞分布情况的研究,为研究其他MCP,更深入了解农杆菌的趋化信号传导机制,进一步改造农杆菌,拓展其利用途经打下基础。