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大肠杆菌是基因工程领域中使用最广泛的表达宿主菌之一,在发酵过程中存在杂菌污染和噬菌体侵染的问题,目前仍缺乏有效的解决策略。为解决上述问题,本研究以大肠杆菌为研究对象,旨在构建一株能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌工程菌。在大肠杆菌中增加两条新的稀有氮磷源代谢途径（抗杂菌系统）,其表达的甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶能专一性催化甲酰胺和亚磷酸盐分别成为铵根离子和磷酸盐作为大肠杆菌生长的氮源和磷源,以防止杂菌污染。在此基础上引入抗噬菌体系统（CRISPR/Cas9）,赋予大肠杆菌工程菌抵抗噬菌体的能力。构建得到的具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌将具有非常巨大的应用潜力。本课题组通过对具有自主知识产权的类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis CS0611的转录组进行分析,发现该菌的基因组中含有甲酰胺酶基因,并利用PCR技术扩增得到了该基因的全长序列;另外,通过菌种筛选得到一株能利用亚磷酸盐的肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae strain OU07,并成功克隆了亚磷酸脱氢酶基因的全长序列。详细地分析了两种酶基因及对应蛋白的序列信息和催化结构,发现甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因的完整开放阅读框分别由1014 bp和1011 bp核苷酸组成,并分别编码337和336个氨基酸。其中,来源于P.pasadenensis CS0611的甲酰胺酶属于腈水解酶超家族,为六聚体,包括3个AB二聚体,每个二聚体均由A和B单元组成;该蛋白的二级结构由24.6%的α螺旋,27.0%的β折叠和48.4%的转角组成;Glu60、Lys129和Cys162构成了该甲酰胺酶与甲酰胺结合的催化三联体。来源于K.pneumoniae strain OU07菌株的亚磷酸脱氢酶属于D-2-羟酸脱氢酶家族,该蛋白的二级结构由35.4%的α螺旋,11.9%的β折叠和52.7%的转角组成,且该序列与来源于Pseudomonas stutzeri WM88的亚磷酸脱氢酶序列具有99.4%的相似性。将甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因分别插入表达载体,构建得到的重组质粒分别转化入大肠杆菌,均可实现高效表达。然后总蛋白经GST标签柱分离纯化后,得到纯的重组FmdA和重组PtxD,继而系统地探讨了两种酶的酶学性质。研究发现,重组FmdA和重组PtxD的最适反应温度分别为30 ℃和35 ℃,最适反应pH分别为6.5和7.0。在最适反应条件下,重组FmdA和重组PtxD的比活力分别为10.0 U/mg和10.8 U/mg。通过对两种酶的稳定性进行研究,重组FmdA在温度低于40 ℃和pH为6-8时的稳定性良好;重组PtxD在温度低于30 ℃和pH为5-8时稳定性良好。此外,金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+和表面活性剂SDS对重组FmdA催化甲酰胺的水解具有明显的抑制作用;金属离子Li+、Zn2+、Mo2+和Fe3+对重组PtxD催化亚磷酸盐氧化为磷酸盐产生了明显的抑制作用,Cu2+、Pb2+和表面活性剂SDS完全或几乎完全抑制该酶的催化活性。另外,EDTA对两种重组酶均没有明显的抑制作用,这表明这两种酶可能均属于非金属酶。酶学性质研究表明,重组FmdA和重组PtxD的最适温度和最适pH都接近大肠杆菌的最适生长条件。本文采用融合表达和共表达两种方式把甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因构建到同一个重组质粒（作为抗杂菌系统）中,于大肠杆菌中成功表达,使得到的重组菌在营养缺陷型MOPS培养基中能利用甲酰胺和亚磷酸盐作为氮源和磷源进行生长繁殖。结果表明,以融合表达构建方式得到的重组菌生长速度最快且合成绿色荧光蛋白的荧光强度最大。该重组菌在营养缺陷型MOPS培养基中能高效抵抗杂菌的污染,在培养过程中始终为优势菌。随后,向已具有抗杂菌系统的重组菌中导入CRISPR/Cas9系统（抗噬菌体系统）的质粒,得到的加强型大肠杆菌在LB液体培养基中能高效抵抗T7噬菌体的侵染,但在营养缺陷型MOPS培养基中生长缓慢（第6天达到稳定期）且抵抗噬菌体效率有所降低。为加快加强型大肠杆菌工程菌的生长速度,本研究对调控融合基因的启动子进行了优化。研究发现,中等强度的组成型启动子（BBa＿J23101和BBa＿23106）最有利于工程菌的生长,能使工程菌的生长速度大幅加快。另外,通过将具有相同复制子的质粒进行整合,使双系统的质粒种类减少到能互相兼容的2种,结果表明优化后的加强型大肠杆菌在营养缺陷型MOPS培养基中培养约8 h后达到稳定期,相比优化前的生长速度提高了7.5倍,且能抵抗浓度高达2×107 PFU/m L的T7噬菌体侵染,并且保持高效的蛋白合成能力。以加强型大肠杆菌工程菌为宿主菌,高效表达了3种酶基因（环氧化物水解酶基因、羰基还原酶基因和脂肪酶基因）,并以能表达环氧化物水解酶的加强型大肠杆菌全细胞为催化剂动力学拆分外消旋邻甲苯基缩水甘油醚制备对映体纯的（R）-邻甲苯基缩水甘油醚。研究表明,在反应温度为25 ℃和pH 7.0的条件下,利用E.coli Rob3全细胞动力学拆分20 m M rac-o-GMPE制备（R）-o-GMPE,在12 min的反应时间内,产物的最大产率和ee分别为23.0%和99.2%,湿细胞比活性为6416.7 U/g。另外,为减轻底物对催化的抑制作用和产物对细胞的毒害作用,通过采用体积比为0.5:1的水缓冲液和乙酸丁酯双相体系动力学拆分3 M rac-o-GMPE,使初始反应速率提高到549.7 m M/h,最终得到（R）-o-GMPE的ee为91.7%,产率为17.1%,时空收率为3.66 g/L/h。