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在植物所必须的营养元素中,磷是非常重要的一个,它参与了植物的生物合成、信号传导和能量转移等重要生理生化过程。大豆根只可以吸收土壤中以无机磷离子存在的磷,然而由于风化、侵蚀和金属离子的氧化固定,土壤中可以被大豆所利用的有效磷含量都比较低。因此,磷元素的利用率往往成为了限制大豆能否高产的一个重要的因素。本研究从信号传导和转录调控两个方面分别选择SPX家族和WRKY家族探究大豆磷饥饿调控的分子机制。其中,SPX结构域的蛋白在细胞水平上参与了磷酸盐内稳态,在磷酸盐代谢过程中起了非常重要的作用。在拟南芥中有四个家族成员,其中AtSPX1-AtSPX3在磷饥饿胁迫响应中起到了负向调控作用。在水稻中已报道了六个SPX蛋白,并且与拟南芥SPX蛋白有相似的调控作用。在豆科植物中,菜豆已报道了三个SPX蛋白,大豆中已报道了 9个SPX蛋白,其中PvSPX1和GmSPX3在磷信号通路中起正向调控作用。WRKY转录因子是一个拥有众多基因成员的家族,在拟南芥中有74个基因、水稻中有109个基因、大豆中也有超过64个基因。并且,越来越多的证据表明WRKY在植物转录水平上广泛参与了生物和非生物胁迫的反馈调控通路中。获得的主要结果如下:1.以拟南芥SPX基因的序列为探针,在大豆基因组数据库Phytozome和NCBI数据库中进行检索比对,发现在大豆中至少有10个仅含有SPX结构域的基因,并分别命名为GmSPX1～GmSPX10。生物信息学分析发现,GmSPX1～GmSPX10可以分成3个亚家族。基因结构分析发现,每一个GmSPX1～GmSPX10都包含有3个高度保守的亚结构域。荧光定量PCR分析发现,大豆根和叶中的GmSPX1～GmSPX10均会受到磷饥饿胁迫诱导表达,并且磷供给恢复一天后,表达量也随之迅速下降,说明GmSPX1～GmSPX10的表达对磷浓度的变化非常敏感。2.从大豆中克隆得到GmSPX1。构建融合表达载体pJIT166-GFP-GmSPX1,通过转化洋葱表皮细胞和拟南芥原生质体进行亚细胞定位研究,发现GmSPX1在整个细胞内均有定位信号。将35S::GmSPX1分别转入Col-0型的拟南芥和spx3中,繁种到T3代,分别命名为OXSPX1和spx3/OXSPX1。在全磷和低磷环境下,磷饥饿诱导相关基因(PSI)AtPHT1-4,AtPHT1-5,AtACP5,AtRNS和 的表达量在spx3中与WT相比都大幅上调。而且在全磷条件下这些PSI基因的表达会受到GmSPX1过表达的抑制。这些结果表明GmSPY1可能在磷饥饿调控中起到了负向调控的作用。然而spx3和WT在无磷的条件下,PSI基因的表达并没有发现显著的差异。综上所述,GmSPX1和AtSPX3对PSI基因的负向调控作用可能要依赖磷离子的信号传导。3.在全磷检测实验中发现,OXSPX1和spx3/OXSPX中的全磷含量均显著低于WT和spx3。利用H2DCF-DA染色法,检测活性氧变化,结果发现OXSPX1和spx3/OXSPX根尖的活性氧含量均高于WT,说明GmSPX1会抑制活性氧的清除。最后观察根结构的变化,发现在低磷环境下OXSPX1和spx3/OXSPX1根毛的长度显著变短,而且根毛的数量也显著变少。通过qRT-PCR分析发现根毛发育相关基因AtUBP14、AtPIP5K-1和AtPIP5K-3的表达均受到GmSPX1过表达的抑制,说明GmSPX1是通过负向调控AtUBP14、AtPIP5K-1和AtPIP5K-3的表达来抑制根毛发育的。4.以GmSPX1蛋白为诱饵,利用酵母双杂交筛库技术筛选大豆根cDNA文库,发现GmSPX1可以与GmMYB48互作,在之后的酵母双杂交一对一验证和双分子荧光互补(BiFC)验证中也证实了这一互作。GmMYB48基因是一个属于MYB家族的转录因子,通过qRT-PCR分析发现它可以受到磷饥饿胁迫的诱导表达,是一个潜在的磷饥饿调控基因。为研究GmSPX1是否会影响GmMYB48的表达,在拟南芥数据库Tair中通过BLAST,检索到GmMYB48在拟南芥中的同源基因AtMYB4。全磷和磷饥饿胁迫条件下OXSPX1中AtMYB4的表达量都显著下调;与之相反,在磷饥饿胁迫下spx3中AtMYB4的表达量都显著上调,表明GmSPX1是AtMYB4的负调控因子。5.在Gm WRKY75基因的功能研究中发现,全磷和低磷环境中GmWRKY75过表达拟南芥(OXWRKY75)的总磷含量相较于WT均有显著上升,而拟南芥wrky75 T-DNA突变体的总磷含量相较于WT略有下降。对根结构的观察发现,与WT相比OXWRKY75侧根和根毛的发育均明显受到抑制。以GmWRKY75蛋白为诱饵,利用酵母双杂交筛库的方法筛选大豆根cDNA文库,发现GmWRKY75可以与GmPAP22-1蛋白发生互作,在之后的酵母双杂交一对一验证和双分子荧光互补(BiFC)验证中也证实了这一互作。GmPAP22-1编码一个酸性磷酸酶,亚细胞定位实验证实它编码的蛋白定位在细胞膜上,这与分泌蛋白的特性相符。GmPAP22-1在大豆中有两个同源基因,分别为GmPAP22-2和GmPAP22-3,可以把这三个基因都划分在GmPAP22亚家族中。磷饥饿处理qRT-PCR分析发现GmPAP22-1-GmPAP22-3均会受到磷饥饿胁迫诱导表达,并且在恢复磷供给培养一天后它们的表达量都显著下降。为了研究GmWRKY75是否会影响GmPAP22-1的表达,通过BLAST比对检索到GmPAP22-1在拟南芥中的同源基因AtPAP22进行相对表达量分析,qRT-PCR分析发现OXWRKY75地下部中AtPAP22的表达显著下调,而地上部中AtPAP22的表达显著上调。