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研究背景:胃癌是世界范围内常见消化道恶性肿瘤,我国是胃癌高发国家,据2018年的最新统计,我国胃癌的死亡人数仅次于肺癌,约占全球胃癌死亡病例的一半。由于早期胃癌在我国的检出率较低,多数病例确诊时已是进展期,五年总生存率不到30%。因此,探索胃癌发生、发展的分子机制,寻找早期诊断标志物和有效的治疗靶点,对于帮助改善胃癌患者预后是非常必要的。环状RNA(circular RNAs,circ RNAs)是一种新的单链闭合环状非编码RNA分子,没有5′帽子结构和3′多聚腺苷酸尾结构,能够抵抗核酸外切酶的消化作用。大多位于细胞浆中,在人类细胞中表达量丰富,具有稳定性、保守性和组织特异性特点。随着高通量测序技术和生物信息学的发展,越来越多的circ RNA被发现,大部分circ RNA存在micro RNA(miRNA)应答元件,可通过碱基互补配对方式竞争性结合miRNA,抑制miRNA对下游靶基因表达的负调控作用。近年来的研究发现circ RNA与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展有关。circPEX6是我们在GEO(Gene Expression Omnibus)高通量测序数据库中筛选出的新的环状RNA分子,由PEX6(peroxisomal biogenesis factor 6,过氧化物酶体生物发生因子6)基因的2、3外显子反向剪接而成,circPEX6在胃癌组织中的表达低于其邻近癌旁组织。然而,关于circPEX6在胃癌发生、发展中的作用和潜在分子机制尚未确定和阐明。Micro RNA-501-5p(miR-501)已被报道在肝癌、胃癌、肺腺癌和子宫颈癌等多种肿瘤中发挥促癌作用。我们通过miRanda、RNAhybrid和Target Scan生物信息学分析软件,预测出circPEX6与miR-501之间有结合位点,肿瘤抑制基因真核翻译起始因子4e家族成员之一的eIF4E3(eukaryotic translation initiation factor 4e family member 3)可能是miR-501的靶基因。因此我们将通过体外细胞实验探讨circPEX6作为miR-501海绵,抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制,以期为胃癌诊断、治疗提供新的潜在靶点。目的:(1)探讨circPEX6对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。(2)探讨circPEX6通过miR-501/eIF4E3轴调控胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。方法:(1)通过GEO数据库分析胃癌组织与相应癌旁组织的高通量测序结果,筛选在胃癌组织中低表达的circ RNA,通过circ Base数据库分析其位置和来源;采用放线菌素D实验和RNase R实验验证circPEX6的环状特性;通过FISH(荧光原位杂交)技术结合激光共聚焦显微镜,观察circPEX6在细胞中的定位。(2)利用Lipofectamine 2000转染circPEX6过表达载体(circPEX6)和空载体(Vector)、miR-501 mimic(miR-501)和miRNA无关序列(NC)、circPEX6和miR-501 mimic(circPEX6+miR-501)以及针对eIF4E3的si RNA(si-eIF4E3)及其对照(NCi)。(3)采用SYBR Green染料法qRT-PCR技术检测circPEX6、PEX6 m RNA和eIF4E3 m RNA在胃癌细胞系中的表达水平,Taqman探针法qRT-PCR技术检测miR-501表达水平以及Western blot方法检测eIF4E3蛋白表达水平。(4)通过CCK-8实验和细胞克隆形成实验检测各组胃癌细胞增殖能力;Transwell小室实验(有或无Matrigel)检测各组胃癌细胞迁移和侵袭能力。(5)化学合成包含miR-501结合位点的野生型circPEX6序列(circPEX6-wt)和miR-501结合位点突变的突变型circPEX6序列(circPEX6-mut),插入GV272载体Xba I酶切位点,通过双荧光素酶报告基因实验验证circPEX6与miR-501之间的靶向结合。同理化学合成包含miR-501结合位点的野生型eIF4E3 m RNA 3′UTR序列(eIF4E3-wt)和miR-501结合位点突变的突变型eIF4E3 m RNA 3′UTR序列(eIF4E3-mut),利用Xba I酶切位点插入GP-miRGLO载体,通过双荧光素酶报告基因实验验证eIF4E3为miR-501的直接靶点。结果:(1)从GEO数据库中筛选出在胃癌组织中低表达的circPEX6,也称hsa＿circ＿0005038(chr6:42941740-42942776),是从位于6p21.1号染色体上的PEX6基因的第2和3外显子环化而成,其基因组序列长度为1036 bp,并最终形成248nt的环形结构。qRT-PCR结果显示,与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,circPEX6在胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、MGC-803和AGS中的表达显著降低(P＜0.05或P＜0.01),尤其是在BGC-823和MGC-803细胞中。(2)用放线菌素D处理后circPEX6在BGC-823和MGC-803细胞中的半衰期均超过24 h,而线性PEX6 m RNA的半衰期分别约为12 h和8 h;RNase R实验显示,circPEX6经RNase R处理后在BGC-823和MGC-803细胞的表达水平与处理前相比几乎未变,而线性PEX6 m RNA表达水平则显著降低了96.57%±0.23%(P＜0.01)和92.73%±0.50%(P＜0.01),表明circPEX6比线性PEX6 m RNA更稳定;FISH实验显示发出红色荧光的circPEX6主要分布在BGC-823细胞的细胞浆中。(3)CCK-8实验显示,转染circPEX6的BGC-823和MGC-803细胞培养5天后在450 nm处的吸光度比空载体组分别降低了27.26%±4.32%和31.3%±3.72%(P＜0.01);细胞克隆形成实验显示,circPEX6组细胞克隆集落数分别为384±36和104±14,与Vector组681±25和228±30相比,均明显降低(P＜0.01)。(4)Transwell小室迁移实验(无Matrigel)结果显示,BGC-823细胞中circPEX6组穿膜细胞数为303±28,与Vector组577±36相比,差别显著(P＜0.01);MGC-803细胞中circPEX6组为288±33,Vector组为552±62,两者相比明显减少(P＜0.01)。Transwell小室侵袭实验(有Matrigel)结果与迁移实验趋势类似,与Vector组相比,circPEX6组穿膜细胞数明显减少(P＜0.05)。(5)双荧光素酶实验结果显示,与共转染NC和circPEX6-wt相比,miR-501和circPEX6-wt共转染的293T细胞萤光素酶活性降低34.52%±6.39%(P＜0.05),而共转染miR-501和circPEX6-mut时则无明显改变。miR-501在SGC-7901、BGC-823、MGC-803和AGS细胞中的表达水平明显高于GES-1细胞(P＜0.05或P＜0.01)。与阴性对照NC组相比,转染miR-501的BGC-823细胞和MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭能力明显增强(P＜0.05或P＜0.01)。(6)293T细胞共转染miR-501和eIF4E3-wt时的荧光素酶活性与共转染NC和eIF4E3-wt相比,降低44.86%±4.82%(P＜0.01),而共转染miR-501和eIF4E3-mut则改变不明显。与NC组相比,转染miR-501导致eIF4E3 m RNA表达水平显著降低(P＜0.05),eIF4E3蛋白表达水平也显著降低,与eIF4E3-si组趋势一致。eIF4E3敲低可显著增强BGC-823和MGC-803细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05或P＜0.01)。(7)与对照组相比,共转染circPEX6和miR-501可逆转miR-501导致的BGC-823细胞和MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭能力增强;Western blot结果显示,circPEX6+miR-501组eIF4E3蛋白表达水平与NC组接近。结论:(1)circPEX6可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。(2)在胃癌细胞中eIF4E3是miR-501的直接靶点,miR-501可在转录后水平负调控eIF4E3表达,敲低eIF4E3可增强胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。(3)circPEX6可作为miR-501海绵,与miR-501竞争性结合,解除miR-501对eIF4E3蛋白表达的负调控,从而抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。circPEX6可能成为胃癌治疗的新靶点。