骨肉瘤又称为成骨肉瘤,起源于间叶组织,其特点为恶性程度高、转移早、预后情况差和生存率低。据统计骨肉瘤是青少年中最为常见的原发性恶性肿瘤,发病率为百万分之4-5,我国每年诊断新发病例4000-5000例,但患者五年生存率却仅为50%-60%。由于早期医疗技术不成熟,对骨肉瘤发病了解不够深入,导致骨肉瘤患者生存率一直处于较低水平。随着目前研究的逐渐深入,多种治疗手段被用于骨肉瘤治疗中,例如放射疗法、新辅助化疗、冷热消融疗法以及分子靶向疗法等。目前骨肉瘤患者的五年生存率已经提高到70%。但是由于骨肉瘤恶性程度较高、易转移和耐药性高等特点进一步限制了临床干预效果。因此需要更加深入的了解骨肉瘤发病机制,寻找新的分子治疗靶点,为提高患者生存率,改善患者生存质量提供新的治疗途径。转化生长因子β调节蛋白4(Transforming growth factor beta regulator 4,TBRG4)也被称为细胞周期进程修复蛋白2(Cell cycle progression restoration protein2,CPR2)和Fas活化激酶结构域蛋白4(Fast kinase domain-containing protein4,FASKTD4)。研究发现TBRG4在调控细胞周期和线粒体功能中具有重要作用。TBRG4表达升高时能够特异性地影响细胞周期分支G1停滞信号,可能通过对CLN1(蜡样脂褐质沉因子1)和CLN2(蜡样脂褐质沉因子2)在转录水平上或者稳定性上影响菌株,同时保持转录诱导分支的完整性。除此之外,TBRG4被发现参与多种类型的肿瘤进程。在乳腺癌相关研究中发现,TBRG4的表达与乳腺癌细胞的恶性程度成正比,其表达升高时细胞迁移能力也逐渐升高,同时降低TBRG4表达可促进乳腺癌细胞凋亡。除此之外,在神经胶质瘤、骨髓瘤和皮肤T细胞淋巴瘤中均发现TBRG4的表达异常升高。然而,其在人类骨肉瘤中的作用机制仍不清楚。因此本研究首次对TBRG4在骨肉瘤中作用及其机制进行初步探讨,为阐明骨肉瘤发病机制,寻找骨肉瘤治疗新靶点提供方向。主要研究内容概括如下1.骨肉瘤中TBRG4表达分析本部分研究选取了骨肉瘤患者癌组织和癌旁组织(距离癌组织大于1cm),对其中TBRG4的表达情况进行检测。通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin and eosin staining,HE staining)确定两组织样本癌变程度,免疫组化染色(immunohistochemical staining,IHC staining)确定TBRG4在两种组织样本中的表达情况。结果表明癌变组织中TBRG4的表达水平显著高于癌旁组织,提示TBRG4可能作用于骨肉瘤的发生发展进程。随后选取MG63、U2OS、Saos-2三种人骨肉瘤细胞系,RT-q PCR实验结果表明相比于U2OS细胞和Saos-2细胞,MG63细胞中TBRG4的表达量最高,与另外两组相比具有显著差异(P<0.01)。因此选用MG63细胞进行下一步实验。2.TBRG4稳定抑制细胞株的构建本部分研究选用前期实验筛选出的MG63细胞,构建TBRG4-sh RNA慢病毒载体并对其敲减效率进行检验。首先以TBRG4基因作为模板设计RNA干扰靶点序列并制备特异性TBRG4干扰片段。将酶切后的目的载体与制备的干扰片段连接后转入大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆测序实验挑选出完全与目标序列一致的克隆结果,用于下一步质粒转染实验。本研究采用三质粒共转染技术制备慢病毒载体(包括TBRG4载体质粒、病毒包装辅助质粒(Helper 1.0)和病毒包装辅助质粒(Helper 2.0))。将三种质粒共同转染293T细胞,浓缩纯化后进行物理状态检测、无菌检测和病毒滴度检测,使获得的慢病毒颗粒能够满足下游实验要求。最后将通过检测的慢病毒表达载体在最佳转染条件下转染MG63细胞,并通过荧光染色、RT-q PCR和Western-blot实验验证MG63细胞中TBRG4的敲减效率。实验结果表明,构建的慢病毒载体能够显著沉默TBRG4基因的表达,可以支持后续研究。3.TBRG4对骨肉瘤MG63细胞的影响为了进一步明确TBRG4对骨肉瘤MG63细胞的影响,本部分研究使用前期实验构建的慢病毒表达载体sh TBRG4和sh Ctrl转染MG63细胞,采用高内涵实验、细胞活力实验、基质成球实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验从骨肉瘤细胞生长、增殖、凋亡等角度对TBRG4功能进行分析。在高内涵实验中,从第二天开始,sh TBRG4转染组MG63细胞数量相比sh Ctrl组开始显著下降,提示敲减TBRG4可能抑制MG63细胞的生长。细胞计数(CCK-8)法检测细胞活力结果显示,从第二天开始,sh TBRG4组MG63细胞的增殖倍数逐渐低于sh Ctrl组,表明敲减TBRG4表达能够明显抑制MG63细胞的增殖。在基质成瘤实验中sh TBRG4转染组在培养11天内MG63细胞成球体积未发生明显变化,因此TBRG4敲减后MG63细胞的成瘤能力可能受到抑制。克隆形成实验中,培养14天后,sh TBRG4组细胞平均菌落数显著低于sh Ctrl组(P<0.05),表明TBRG4表达降低能够降低骨肉瘤细胞的集落形成能力。最后采用Annexin V-APC单染法检测sh TBRG4和sh Ctrl转染MG63细胞凋亡情况,结果显示sh TBRG4组细胞凋亡率显著高于sh Ctrl组(P<0.01),提示敲减TBRG4表达可促进MG63细胞凋亡。4.TBRG4基因芯片的构建与分析本部分研究进一步探讨TBRG4作用骨肉瘤的相关机制。采用人表达基因谱技术构建TBRG4基因芯片,并通过Benjamini-Hochberg法对基因芯片数据进行校正。根据经验贝叶斯分布的线性模型对所构建基因芯片数据进行显著性差异分析结果显示:与sh Ctrl组相比,sh TBRG4组中2268个基因显著变化,其中1134个基因上调,1134个基因下调。为了验证基因芯片的准确性,我们选取了OLR1、KAT2B、SQSTM1等30个差异基因进行RT-q PCR检测。结果表明,选取基因的表达与基因芯片结果均一致。随后通过IPA数据分析平台,对TBRG4基因芯片数据进行分析。在对著差异基因进行相关通路富集后发现,共有13条经典通路发生显著性差异改变:6条通路被显著激活,其中胆固醇超途径(Superpathway of Cholesterol Biosynthesis)激活效应明显(Z=2.449);7条通路被显著抑制,其中3-磷酸肌醇生物合成途径(3-phosphoinositide Biosynthesis)抑制最为明显(z=2.449)。在差异基因的上游调控因子分析中双吲哚马来酰胺I(bisindolylmaleimide I)的激活效应最强,转录因子P65(RELA)的抑制效应最强。对相关疾病及功能的富集情况分析认为,RNA转录(Z=-2.795)等功能被显著抑制,而围产期死亡(Perinatal death,Z=3.58)等疾病被显著激活。对参与的上游调控网路和下游功能可能涉及途径分析表明,调控子AGER,ALB,ARRB2等通过ATF3,BMP2,IGFBP5等基因对碱性磷酸酶水平升高(Increased Levels of Alkaline Phosphatase)具有抑制作用。最后对下游调控因子之间的相互作用关系进行分析,结果表明敲减TBRG4表达后其下游16个相关基因发生下调,16个相关基因发生上调。