代谢在生物系统中起着重要的作用。生命体组成的基本单元是细胞,对细胞代谢产物的分析,可以了解生物系统的生理和病理反应机制以及细胞间信息的传递,将有助于探索生命活动的规律,为疾病的诊断与治疗提供有力的依据。由于样品基质复杂,肿瘤标志物的含量一般极低,细胞代谢物的分析需要高灵敏度、高选择性的分析方法。常规细胞代谢物的分析方法往往具有操作繁琐、分析时间长、分析效率低以及成本高的缺点,甚至由于灵敏度低而无法进行分析。近年来逐渐发展起来的微流控芯片技术由于具有通道体积小,所需样品量少,高通量分析的特点,在当前的细胞研究中占据重要的地位。为了更好的模拟体内微环境,本文将在微流控芯片上对体内微环境进行模拟并对两种细胞进行共培养,开展了一系列以细胞为基础的在芯片上进行的研究。核酸适配体由于其高特异性,高亲和力而广泛应用于蛋白、小分子乃至细胞的分析。功能核酸适配体还可以通过滚环扩增(RCA)、聚合酶链式反应(PCR)等手段对目标DNA进行放大,极大的提高了分析的灵敏度。本文将在微流控芯片平台上利用核酸适配体对与疾病相关的细胞代谢物以及相应的分子机制展开一系列的研究。具体开展了以下四个方面的工作：1、将微流控芯片技术和适配体的免疫分析技术相结合,实现了人血浆中凝血酶的便携式检测。为了提高凝血酶检测的线性范围和灵敏度,利用核酸适配体的可控性将G.四链体DNAzyme与适配体组装,并利用滚环扩增技术(RCA)和G.四链体DNAzyme实现信号的双放大。同时,利用G.四链体DNAzyme在铁离子的作用下快速催化ABTS-H2O2,增强吸收,改变颜色,实现了人血中凝血酶的可视化分析。最终,将所建立的方法成功用于人血浆和血清中凝血酶的检测。所建立的方法还可以用于其它肿瘤标志物的检测,并有望应用于临床样品中肿瘤标志物的分析,在疾病的诊断中具有潜在的应用价值。2、利用核酸适配体对目标标志物进行DNA标记,实现了多种标志物的同时分析。利用核酸适配体的可控性,对VEGF165, PDGF-BB,和凝血酶,分别设计和组装三条不同长度的适配体,通过改变它们的带电量,从而改变标志物与DNA复合物的迁移速度,使用芯片毛细管电泳进行分离,实现了三种标志物的快速定量分析。由于蛋白质的高分子量,每个蛋白质的带电量固定,所以蛋白质与配体的迁移速度之差主要由可控配体所携带的电子量决定。另外,假设每一个碱基携带一个电子,而互补的碱基则不带电子,通过设计不同长度的单链DNA,可以得到不同的带电量,从而可以改变适配体的迁移速度,以及配体与蛋白质复合物在芯片毛细管电泳中的迁移速度。由于细胞代谢物基质的复杂性,会影响三种标志物的分离度。为了提高分离度,减少基质的干扰,实现定性定量分析,引入了一条低分子量的DNA和一条非特异性的DNA作为内标物并抑制干扰。最终实现了不同细胞中三种代谢物的分析检测,有望将所建立的方法用于其它小分子代谢物的分析,为疾病的诊断、肿瘤的发生发展检测以及新标志物的发现和药物筛选提供新的方法和手段。3、构建一个集成化的微流控芯片,用于细胞的共培养、缺?氧诱导以及代谢物VEGF165的在线分析。两层的微流控芯片用于构建氧梯度微环境和代谢物的在线检测装置。细胞培养箱中不同长度的连接通道用于考察距离对细胞间相互作用的影响。分别用5%,15%和20%的氧含量对细胞进行刺激,不仅对细胞的形态、增殖率和凋亡进行了观察,还研究了不同氧含量对活性氧、分泌物VEGF165蛋白表达量变化的影响以及已经相关基因(HIF-1α和VEGF165)的研究,深入探索了细胞间的信号传导,为宫颈癌的研究提供了一些依据。4、设计了一种简单的微流控芯片,实现了三种物质的快速混合,并将其用于VEGF165和可控适配体之间的动力学研究。其中,微流控芯片主要包含了三个不同功能的单元结构：(1)在混合区前端的三个进样通道上各自加入一段蛇形通道,用于减少进样带来的压力和流速的偏差。(2)为了加快VEGF165.可控配体以及铱复合物荧光探针的快速混合,再设计一段40微米宽的混合区域。(3)在混合区域后面再加一段长的蛇形通道,这样不仅能够使三种物质完全混合,还可以通过选择不同的位置来观察VEGF165与可控配体之间的动力学变化情况。通过构建对G.四链体结构有高选择性的铱复合物荧光探针,设计和组装VEGF165适配体和G.四链体的可控配体,实现了VEGF165与可控配体之间动力学的研究,并用于细胞代谢物中VEGF165的分析检测。最后,将所建立的方法用于研究在紫杉醇刺激下,宫颈癌细胞CaSki中VEGF165的含量变化,为宫颈癌的机理研究和药物作用研究提供依据。5、在分析检测中,虽然蛋白质的检测以及药物的检测都有单独相应的检测方法,但是目前还没有相应的检测方法或者平台能同时实现蛋白质的检测和药物的代谢检测。本课题以VEGF165、PDGF-BB以及凝血酶为检测目标物,将紫杉醇作用于共培养下的宫颈癌和内皮细胞,进而考察它们的相关代谢物。为了实现高选择性分析以及特异性捕获,我们利用核酸适配体进行目标物的捕获和检测。同时利用滚环扩增技术(RCA)和G.四链体DNAzyme来提高分析的灵敏度。在分析的平台上集成了质谱和荧光显微镜,不仅可以实现代谢物的分析,还可以对细胞的形态进行实时监测。此外,我们在芯片上集成了在线固相微萃取对代谢后的紫杉醇进行萃取。最终实现了紫杉醇和三种蛋白质的同时检测以及细胞形态的观察。因此,我们相信这个集成化的平台不仅可以实现高通量低成本的分析,还用于疾病诊断和药物的筛查中。