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在世界范围内,缺血性脑卒中逐渐成为了威胁人类生命健康的一大疾病,且临床上针对该疾病的治疗手段仍十分有限。近年来,围绕delta阿片受体(delta opioid receptor,DOR)对脑缺血的神经保护作用日益受到研究者的关注。本实验室前期研究结果表明,用[d-Ala2,d-Leu5]脑啡肽(DADLE,DOR激动剂)激活DOR可以显著减轻脑缺血损伤,对脑缺血引起的认知损伤有明显改善作用。此外,DOR活化可以改善脑缺血3天后神经元存活,促进星形胶质细胞活化,减少受损的星形胶质细胞。然而,DADLE激活DOR促进缺血神经元存活的具体机制却并不清楚。我们在体外研究中关注到,DADLE激活DOR通过促进自噬可以显著减轻星形胶质细胞糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)损伤。而近年来的研究报道均表明,自噬在脑缺血损伤中发挥重要的作用。其中,自噬启动相关的Unc-51样激酶(UNC-51 like kinase 1,ULK1)主要受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的调节。因此,我们推测DADLE激活DOR改善缺血神经元存活可能与AMPK介导自噬途径调控有关。本课题在Sprague Dawley大鼠全脑缺血损伤模型和SH-SY5Y细胞糖氧剥夺再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)损伤模型上进行研究,结合组织化学、细胞和分子生物学技术手段,探究DADLE激活DOR对脑缺血损伤后神经元自噬变化的影响及其AMPK介导的自噬调控机制。课题内容分为两部分,具体内容如下:1.DOR活化对大鼠全脑缺血损伤后细胞自噬的影响及其分子机制研究为了模拟临床脑缺血损伤,构建大鼠全脑缺血损伤模型。采用脑缺血后处理(Ischemia postconditioning,IPO)方式,经侧脑室给予不同药物处理,通过蛋白免疫印迹(Western blotting)检测DADLE对脑缺血后DOR的影响。通过Western blotting检测自噬相关蛋白LC3和P62的变化,反映DOR活化对脑缺血损伤后自噬的影响。通过NeuN标记神经元,观察大鼠海马神经元存活情况,探究自噬对DOR介导神经保护作用的影响。同时,通过GFAP标记星形胶质细胞,观察大鼠海马CA1区星形胶质细胞状态,探究自噬对DOR调控缺血后星形胶质细胞活化的影响。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)和Western blotting研究脑缺血后DOR介导自噬调控机制。实验结果表明:1)DADLE可以显著提高缺血后DOR表达水平。2)DOR活化提高缺血后LC3 II/LC3 I水平,降低P62水平,促进细胞自噬。DADLE与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)联用消除了DOR对改善缺血CA1神经元存活和调控缺血后星形胶质细胞活化的保护效果。3)脑缺血损伤后,DOR活化激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进自噬。DADLE与AMPK抑制剂Dorsomorphin(Compound C)联用消除了DOR活化改善缺血CA1神经元存活的保护作用。2.DOR活化对SH-SY5Y细胞OGD/R损伤后自噬的影响及其分子机制研究我们构建SH-SY5Y细胞OGD/R损伤模型,体外模拟脑缺血损伤。通过细胞活性实验检测不同剂量DADLE和DOR抑制剂Naltrindole对SH-SY5Y细胞的影响,并探究OGD/R损伤后DOR活化对细胞活力的影响。通过Western blotting检测LC3和P62的变化,以及mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染实验观察细胞自噬流(autophagic flux)的变化,研究DOR活化对OGD/R损伤后细胞自噬的影响。通过单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色实验和Western blotting对DOR活化诱导自噬的调控机制进行探究。实验结果表明:1)DADLE激活DOR可以减轻细胞OGD/R损伤。2)DADLE可以提高OGD/R损伤后DOR水平。3)DOR活化提高OGD/R损伤后LC3 II/LC3 I水平,并降低P62水平,促进损伤后细胞自噬。同时,DOR活化改善OGD/R损伤引起的自噬流障碍。4)OGD/R损伤激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进自噬,而DOR活化进一步促进AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强OGD/R损伤后细胞自噬。DADLE与Compound C联用抑制了DOR介导自噬升高的作用。综上所述,脑缺血损伤后,DADLE激活DOR通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进神经元自噬,改善缺血神经元存活,发挥神经保护作用。课题研究结果为DOR介导神经保护作用提供了新的实验证据,首次揭示了DOR介导自噬对缺血神经元的影响,加深对DOR调控下游分子通路的理解和认识,进一步扩充完善了DOR在脑缺血损伤中具体神经保护机制,而AMPK依赖的DOR介导自噬机制可以提供新的思路和药物靶标,有助于寻找脑缺血治疗的新方案。