【摘 要】
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肌肉是由肌细胞经历发育分化、融合为成熟的肌纤维及肌纤维生长等过程发育而来,这些过程受到多种基因的调控。Shisa蛋白家族是近年来发现的一类含有N端半胱氨酸结构域和C端脯氨酸区的单跨膜衔接蛋白家族,在脊椎动物的发育、癌症的产生和细胞凋亡中发挥重要的作用。shisa-2的表达在鱼类胚胎中具有体节特异性,同时体节是形成肌肉的基础,然而shisa-2在鱼类肌肉生长发育中的功能尚不清楚。本研究以具有重要经济
【机 构】
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中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
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肌肉是由肌细胞经历发育分化、融合为成熟的肌纤维及肌纤维生长等过程发育而来,这些过程受到多种基因的调控。Shisa蛋白家族是近年来发现的一类含有N端半胱氨酸结构域和C端脯氨酸区的单跨膜衔接蛋白家族,在脊椎动物的发育、癌症的产生和细胞凋亡中发挥重要的作用。shisa-2的表达在鱼类胚胎中具有体节特异性,同时体节是形成肌肉的基础,然而shisa-2在鱼类肌肉生长发育中的功能尚不清楚。本研究以具有重要经济价值的海水养殖鱼类牙鲆（Paralichthys olivaceus）和模式生物斑马鱼（Danio rerio）为研究对象,克隆获得了牙鲆和斑马鱼的shisa-2基因,并对其所编码的氨基酸序列进行了分析;通过原位杂交和RTPCR分析了基因在牙鲆和斑马鱼胚胎期的时空表达特点,同时利用q PCR分析了基因在牙鲆二、三倍体胚胎中的表达差异;通过细胞转染的方法,分析了蛋白的亚细胞定位;通过在牙鲆和斑马鱼胚胎中注射m RNA的方法进行基因的瞬时过表达研究,分析了其对肌肉发育标志因子myod表达的影响;构建了肌肉特异启动子驱动的表达载体,期望获得持续过表达的转基因斑马鱼,从而分析过表达shisa-2对肌肉发育的影响;在牙鲆和斑马鱼中进行了基因编辑实验,期望获得shisa-2突变体并分析基因的缺失对肌肉发育的影响。相关研究结果将丰富鱼类肌肉发育和调控机制的理论,为牙鲆等经济鱼类养殖提供参考。1.从牙鲆和斑马鱼中克隆得到shisa-2序列,对氨基酸序列进行分析发现,牙鲆和斑马鱼Shisa-2都具有一个N端的信号肽区域、富含半胱氨酸结构域、跨膜区和脯氨酸区域。通过构建系统发育进化树发现,牙鲆Shisa-2与罗非鱼、金头鲷的聚在一起,而斑马鱼Shisa-2与鲤鱼的聚在一起。2.RT-PCR分析表明,牙鲆shisa-2在未受精卵中有微弱表达,在原肠期之后,随着肌节的形成,shisa-2的表达量逐渐增加;原位杂交显示shisa-2表达在体节中,同时表达在早期脑泡、视泡、耳囊、鳃弓中。在斑马鱼胚胎中,在原肠期以后,其在逐渐发育形成的前体节中胚层中表达量较高,在早期脑泡、视泡、耳囊中也表达。这些结果表明shisa-2在牙鲆和斑马鱼中有着体节特异性的表达特征,可能参与了肌肉发育过程的调控。3.在牙鲆和斑马鱼中对shisa-2的功能做了初步探究。将构建的重组表达载体pEGFP-N1-shisa-2转染到Hela细胞中,结果显示Shisa-2蛋白定位在细胞内质网上。在瞬时过表达shisa-2的牙鲆和斑马鱼胚胎中,通过原位杂交发现肌肉特异因子myod的表达受到影响。通过CRISPR/Cas9技术对牙鲆和斑马鱼的shisa-2进行敲除,免疫组化分析牙鲆F0代杂合突变体肌纤维融合及体节形态的情况,结果显示其体节形态出现异常。在斑马鱼中筛选获得了shisa-2敲除的F1代杂合突变体。同时,将构建的肌肉特异性启动子驱动表达shisa-2的载体与Tol2转座酶共注射到斑马鱼胚胎中,经筛选得到了F1代转基因shisa-2斑马鱼。
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