目的:肿瘤DC疫苗是肿瘤免疫治疗中很有前景的方法之一,但随着对肿瘤DC疫苗研究的不断深入,人们发现由于受到肿瘤微环境的影响,单纯使用肿瘤DC疫苗难以获得满意的结果。高能X-射线在杀死肿瘤细胞的同时,还可诱导肿瘤细胞产生HMGB-1及HSP70等内源性因子,增加肿瘤细胞的免疫原性。因此,X-射线照射可促进肿瘤DC疫苗的抗瘤能力。但对X-射线与DC疫苗的联合的方式以及二者联合抗肿瘤的机制的研究还有待进行深入研究。本研究以荷瘤小鼠为模型,首先观察了X-射线照射后,肿瘤DC疫苗注射的时间窗对二者联合抗肿瘤的影响,同时对联合抗瘤的机制进行了较系统的分析。方法:1 DC疫苗制备、活性及其抗原呈递能力检测处死BALB/c小鼠,取小鼠股骨的骨髓细胞,用含有GM-CSF(10ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的完全培养基诱导树突状细胞分化,在培养的第5天,重新收集细胞计数,调节细胞数至1×106/ml,重新加入24孔细胞培养板,加入X射线处理的4T1肿瘤细胞裂解液(终浓度50μg/ml),在37℃含饱和水气、5%的CO2培养箱中孵育16小时,然后再用LPS(100ng/ml)和IFN-Υ(10ng/ml)刺激36h进一步诱导DCs的成熟,以此作为DC疫苗。用终浓度25μg/ml的丝裂霉素C处理的DC细胞做为刺激细胞,反应细胞是雌性C57BL/6小鼠的脾细胞。将反应细胞和刺激细胞分别以200:1、100:1、50:1的比例加入到96孔U型板中孵育96小时,孵育完成之前的4h每孔加入20μl Cell Titer 96®AQueous One Solution Reagent。用MTS比色法来检测反应细胞增殖情况。收集抗原负载的、LPS和IFN-Υ诱导成熟的DCs的培养上清,检测IL-12p70的水平,以了解DC分泌IL-12的情况。同时收集抗原负载的、LPS和IFN-Υ诱导成熟的DCs,流式细胞仪检测CD11c、MHC II、CD86和ICAM-1的表达。2 X-射线对荷瘤小鼠肿瘤组织及肿瘤浸润淋巴细胞细胞因子表达的动态分析2.1 X-射线处理荷瘤小鼠将4T1细胞移植BALB/c小鼠右侧第五对乳腺脂肪垫下,在肿瘤细胞移植的第七天将荷瘤小鼠随机分为3组(8只/组)。未处理组、10Gy×3照射组(10Gy剂量照射,每日一次,连续3天)、30Gy照射组。2.2 Real-time PCR动态分析肿瘤组织及肿瘤浸润淋巴细胞IL-6、IL-10m RNA的表达在X-射线照射肿瘤块后的第2、11和21天,分别处死荷瘤小鼠,分离肿瘤组织,分别提取肿瘤组织和肿瘤浸润淋巴细胞的总RNA,经常规反转录后,用IL-6、IL-10特异性引物扩增。2.3 ELISA分析TGF-β及TNF-α的水平在X-射线照射肿瘤块后的第2、11和21天,分别处死荷瘤小鼠,分离肿瘤组织,PBS洗去血污,用含有蛋白酶抑制剂的500μl PBS进行匀浆,12000r/min,4℃离心15min,取上清,按照试剂盒说明书进行细胞因子测定。3观察X射线联合DC疫苗对荷瘤鼠肿瘤生长情况将4T1细胞经腹部右侧第五对乳腺脂肪垫移植给BALB/c小鼠,在肿瘤细胞移植的第七天将荷瘤小鼠随机分为6组(7只/组)。未处理组、10Gy×3照射组(10Gy剂量照射,每日一次,连续3天)、30Gy照射组、10Gy×3+DC组(最后一次照射后48h,瘤周注射106个DC细胞,一周后再注射一次DC细胞)、30Gy+DC组(照射后48h,瘤周注射106个DC细胞,一周后再注射一次DC细胞)、DC组(瘤周注射106个DC细胞,一周后再注射一次)。接瘤后每天观察肿瘤生长情况。用游标卡尺测量肿瘤直径,按公式(长径×短径2)/2计算肿瘤块的体积(mm3),并观察荷瘤小鼠存活时间,绘制生存曲线。4体内中和实验同上述方法制备4T1荷瘤小鼠,在照射后的第3天,经尾静脉给荷瘤小鼠注射抗TNF-的抗体(20μg/鼠/100μl)或PBS,然后再在瘤内注射106个DC疫苗,一周后再注射一次。观察荷瘤小鼠肿瘤的生长情况。 5 X-射线照射联合DC疫苗诱导长效和系统性抗肿瘤免疫应答的观察5.1给“治愈”的荷瘤小鼠第二次移植肿瘤采用剂量为30Gy的X-射线照射联合DC疫苗治疗后(即10Gy×3+DC和30Gy+DC实验组),部分荷瘤小鼠存活期超过15周。将存活期超过10周且荷瘤鼠的瘤块小于300mm3的认为是“治愈”的荷瘤小鼠。给此小鼠第二次在左侧第二对乳腺脂肪垫下移植4T1细胞。对照组为第一次移植肿瘤的小鼠。5.2流式细胞仪分析荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞表达IFN-γ、CD127和CD44的CD8+T数在第二次移植肿瘤的第28天,处死荷瘤小鼠,取荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞,用肿瘤抗原体外刺激24h,流式细胞仪分析表达IFN-γ、CD127和CD44的CD8+T数。5.3流式细胞仪分析肿瘤组织中CD8+T和调节性T细胞(T-Reg)分布在第二次移植肿瘤的第28天,处死荷瘤小鼠,分离荷瘤小鼠的肿瘤组织并称重。首先采用机械联合酶解的方法得到肿瘤组织的但细胞悬液,再通过密度梯度离心的方法得到肿瘤组织浸润的淋巴细胞。流式细胞仪分析CD4+CD25+和CD8+的T细胞,并计算CD8+T/CD4+CD25+T的比率。5.4肿瘤浸润淋巴细胞CTL活性的测定在第二次移植肿瘤的第28天,处死荷瘤小鼠,分离肿瘤浸润淋巴细胞,再用含有50μg/ml的4T1肿瘤细胞裂解液和10ng/ml的IL-2的完全培养基继续培养7天,以此作为效应细胞。靶细胞为培养至对数生长期的4T1细胞和经射线照射的4T1细胞。CTL活性测定按照标准的比色法和试剂盒说明书进行。结果:1 X射线处理的4T1细胞裂解液负载的DC表现高水平的抗原呈递能力为了制备高活力的DC疫苗,本实验首先获得了经X-射线照射的4T1细胞的裂解液,用这种含有肿瘤抗原的裂解液负载DC并经LPS和IFN-Υ诱导成熟,经流式细胞仪分析可见,MHC II、CD86及ICAM-1的表达与未经X-射线照射的4T1裂解液负载的DCs没有显著差异;除了LPS刺激外,4T1裂解液并不能诱导DC产生IL-12。尽管如此,从 Fig.1c可见,在DC与T细胞比率为50:1的情况下,用射线照射后的4T1裂解液负载的DC疫苗比未经照射的4T1裂解液可明显促进DC的抗原呈递能力(P<0.01)。2 X-射线局部照射后提高肿瘤微环境的TNF-α水平为了解局部X-射线照射对肿瘤组织炎性因子表达的影响,为DC疫苗注射寻找合适的时间窗,首先利用real-time PCR动态分析了肿瘤组织及肿瘤浸润淋巴细胞的IL-10和IL-6的m RNA表达;同时利用ELISA检测了肿瘤组织中TGF-β和TNF-α的水平。Fig.3可见,在X-射线照射后的第2、11和21天,IL-10和IL-6的m RNA及TGF-β的水平均未发生明显变化,而TNF-α的水平在照射后前2周,即第2和11天时明显较未照射组显著提高(P<0.05),在照射后第21天明显又降低。3 X-射线照射可促进DC疫苗的抗肿瘤活性在4T1移植后的第7天,给予X-射线照射,然后在照射后的第3和第18天注射2次DC疫苗。从Fig.2可见,未经处理或仅注射DC疫苗的荷瘤小鼠,在肿瘤移植的第7周全部死亡,单独给予X-射线的荷瘤小鼠,在12周前也全部死亡。在荷瘤的第15周,X-射线照射联合DC疫苗组的荷瘤小鼠依然有20%-50%的存活,且肿瘤块体积均小于300mm3。4 TNF-α中和抗体可解除射线联合DC疫苗对肿瘤生长的抑制进一步分析TNF-α在射线照射促进DC疫苗抗瘤作用的机制,在荷瘤小鼠接受射线照射的第2天,经尾静脉注射抗TNF-α的中和抗体,结果观察到中和抗体不仅下调了肿瘤组织中的TNF-α水平,也明显解除了射线联合DC疫苗对肿瘤生长的抑制(Fig.4)。5 X-射线联合DC疫苗在荷瘤小鼠建立长效和系统的抗肿瘤免疫5.1 X-射线联合DC疫苗“治愈”的荷瘤小鼠抑制第二次移植瘤的生长4T1荷瘤小鼠经过X-射线联合DC疫苗治疗后,虽然有部分荷瘤小鼠死亡,但依然有20%-50%的荷瘤小鼠存活期超过15周(Fig.2)。由于X-射线照射后可明显促进TNF-α的水平,这很可能对DC疫苗诱导肿瘤特异性免疫应答具有促进作用。因此,为了验证这一假设,给存活的荷瘤小鼠在远离“原发瘤”的左侧第二对乳腺脂肪垫移植1×105个4T1细胞,对照组为第一次移植肿瘤的小鼠。由Fig.5可见,100%的对照组小 鼠在肿瘤移植7天后全部见到明显的瘤块,且在荷瘤的第6周全部死亡。而经过联合治疗的荷瘤小鼠在重新移植肿瘤后,有60%的小鼠在第二次移植肿瘤后的第10周才观察到新的肿瘤块。5.2 X-射线联合DC疫苗“治愈”的荷瘤小鼠对肿瘤抗原产生了免疫记忆为了进一步分析荷瘤小鼠的免疫功能,在第二次荷瘤的第4周,处死部分小鼠(每组3只),分析了脾脏淋巴细胞可分泌IFN-γ的CD8+T及表达CD127的记忆性CD8+T细胞数,结果联合治疗组表达CD127的记忆细胞数显著高于对照组,且产生IFN-γ的CD8+T细胞数也多余对照组(Fig.5C)。5.3 X-射线联合DC疫苗可提高肿瘤微环境中CD8+T/T-reg比例和肿瘤特异性CTL活性X-射线联合DC疫苗在荷瘤小鼠可建立长效和系统的抗肿瘤免疫,可能与肿瘤微环境中效应T细胞的募集和CTL杀伤活性提高有关。因此,在联合治疗后的第19天,即最后一次DC疫苗注射后的第10天,分析了肿瘤组织中CD8+T及T-reg细胞数,同时检测了肿瘤组织浸润的淋巴细胞的CTL活性。Fig.6可见,联合治疗组的肿瘤组织中CD8+T或CD8+T/T-reg比例均比对照组明显增加;CTL活性也高于对照组。结论:1 X-射线照射后的前2周,肿瘤组织TNF-α水平升高,适合DC疫苗的注射;2 X-射线联合DC疫苗可诱导长效的抗肿瘤作用;3用抗TNF-α的中和抗体可解除X-射线联合DC疫苗的抗肿瘤作用。