弓形虫病(Toxoplasmosis)是由专性细胞内寄生的弓形虫病原体引起的一种人兽共患寄生虫病，广泛流行于世界各地。正常人感染弓形虫后无明显的临床症状，但孕妇感染后可影响胎儿的发育，严重者导致畸胎、死胎，存活者也常有畸形和智力发育不全等后遗症，并且近年来随着人们生活水平的提高，食物来源的多样化，饮食习惯的改变，饲养宠物人数的增多，弓形虫感染呈明显上升趋势，已经引起国内外学者的高度关注，但因其生活史复杂和致病机理尚不完全清楚，至今尚未找到理想的治疗药物。近年来，随着对弓形虫抗原及其免疫保护性研究发现，研制疫苗可能是预防弓形虫病的最佳策略。P30是国内外研究最多的一种弓形虫表膜蛋白，已被证明为重要的弓形虫免疫保护性抗原；ROP2为弓形虫棒状体分泌的54kDa的蛋白，可以诱导对弓形虫应答的T细胞克隆(TCC)增生，刺激T细胞介导的免疫反应及诸多细胞因子的产生，HSP70是高度保守的应激蛋白，在免疫反应中的主要作用是直接或间接加工递呈抗原HSP70是一种非特异性的细胞保护蛋白，是目前发现的主要分子伴侣蛋白之一[1]，并且有研究显示，出于弓形虫抗原成分复杂、形态多样，出单一功能基因制备的疫苗远远不能激发的宿主免疫反应，难以达到较理想的抗虫目的。因此，本研究利用分子生物学技术，将弓形虫抗原P30与ROP2的基因构建在同一原核表达载体上，并高效表达P30-ROP2融合蛋白，然后将重组子再克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中，再插入HSP70基因，构建出弓形虫P30-ROP2-HSP70复合基因疫苗，为弓形虫疫苗的应用研究奠定了基础。　　 本研究的主要方法、结果及结论　　 l抗弓形虫多克隆抗体（兔血清）的制备　　 方法：选5只体重2.2kg左右的健康家兔，取11mg弓形虫抗原与弗氏完全佐剂(FCA)充分研磨混匀，分别注入家兔后肢胭窝淋巴结内（每条后腿0.5ml左右，相当于每只家兔2.0mg免疫抗原量）。每间隔2周，分别进行第二、三次免疫，抗原量相同，接种部位改为两处后背部皮下。第三次免疫前l天和免疫后2周、4周分别耳静脉或心脏采血，分离血清，以测定免疫血清的抗体效价，效价达到要求后尽快心脏取血。　　 结果：成功制备了弓形虫多克隆抗体。第三次免疫前1天、第三次免疫后4周5只家兔血清中含弓形虫抗体效价多为l：32万左右，第三次免疫后2周5只家兔血清中含弓形虫抗体效价多为1：64万左右。　　 结论：弓形虫多克隆抗体的成功制备为后续的免疫学的研究打下了基础。　　 2弓形虫P30-ROP2复合基因原核表达载体的构建与鉴定　　 方法：将液氮冻存的弓形虫速殖子复苏后，接种于小鼠腹腔，连续传代三次，收集小鼠腹水，分离纯化速殖子，常规方法提取基因组DNA。根据GenBank报道的P30基因和ROP2基因序列的开放读码框架分别设计合成引物；PCR法扩增P30、ROV2基因片段，重叠PCR法扩增P30-ROP2复合基因，经琼脂糖凝胶回收纯化后，克隆至TOPO-TA克隆载体；通过酶切、测序鉴定正确后，将P30-ROP2复合基因片段亚克隆至pET-30a(+)载体，构建成pET-30a-P30-ROP2质粒；转化大肠埃希菌BL21(DE3)，IPZG诱导表达，表达蛋白用SDS-PAGE初步分析，Westernblot分析鉴定。　　 结果：提取弓形虫基因组DNA;PCR扩增出预期的P30片段(684bp)和ROP2片段(1212bp);成功构建了TOPO-P30-ROP2质粒，以及重组表达质粒pET-30a-P30-ROP2;测序结果表明：与GenBank报道的基因序列相比，P30基因有1个碱基发生同义突变；ROP2基因有2个碱基不同，导致1个编码氨基酸发生改变，但都没有改变原序列的开放阅读框架。pET30-P30-ROP2转化大肠埃希菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达出了约75kDa的融合蛋白，Westernblot分析鉴定证实该重组蛋白能被兔血清多克隆抗体识别。　　 结论：pET30a-P30-ROP2重组表达质粒的成功构建、P30-ROP2重组蛋白的高效表达，为下步实验打下了基础。　　 3弓形虫P30-ROP2-HSP70复合基因疫苗的构建　　 方法：重新设计带有所需酶切位点的引物，以构建成功pET30a-p30-ROP2质粒为模板，PCR法扩增P30-ROP2复合基因片段，经琼脂糖凝胶回收纯化后，克隆至TOPO-TA克隆载体。通过酶切、测序鉴定正确后，将P30-ROP2复合基因片段亚克隆至真核表达载体pc-DNA3，构建成pc-DNA3-P30-ROP2质粒。然后体外扩增HSP70基因，插入pc-DNA3-P30-ROV2质粒，转化DH5a，挑取阳性克隆进行酶切、测序鉴定。　　 结果：成功构建了TOPO-P30-ROP2质粒、TOPO-NSP70质粒以及真核表达质粒pc-DNA3-P30-ROP2-HSP70。测序结果表明：与GenBank报道的基因序列相比，P30基因有1个碱基发生同义突变；ROP2基因有2个碱基不同和一个碱基缺失，导致1个编码氨基酸发生改变和框移突变，经补救措施修正了缺失的碱基，HSP70基因完全一致。　　 结论：成功构建了真核表达质粒pc-DNA3-P30-ROP2-HSP70，弓形虫复合基因疫苗的成功构建为弓形虫疫苗的应用研究奠定了基础。