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慢性痛对机体的危害不仅是持续的疼痛感受,还可导致情绪低落和认知功能的下降。迁延、持续的疼痛更容易形成一个“慢性痛后的恶性循环”:慢性痛后可以导致焦虑、抑郁等负性情绪,同时还可因睡眠功能紊乱,活动减弱导致认知功能的降低;而后负性情绪和认知下降又会进一步的加剧慢性疼痛,形成疼痛-负性情绪和认知下降-疼痛的恶性循环。尽管已经有许多的研究开始关注疼痛的情绪成份,探究情绪痛的神经环路,但关于此“慢性痛后的恶性循环”的潜在神经机制仍不明确。而解决这一问题的关键是找到一个同时参与了疼痛的调控、负性情绪的形成和认知功能维持的神经核团。背内侧前额叶皮层(dmPFC),包括吻侧前扣带回(rACC)和缘前皮层(PL)就是这样一个可同时参与疼痛、负性情绪和认知功能的关键中枢部位。dmPFC已经被证实广泛参与了焦虑抑郁负性情绪和认知功能障碍的产生。尽管也有研究观察到dmPFC可以参与慢性痛,但其详细的神经通路仍不清楚。中脑导水管周围灰质(PAG)-延髓吻端腹内侧结构(RVM)-脊髓背角(SDH)是中枢神经系统内重要的下行疼痛调控通路,但关于此条神经通路上位中枢的传入研究鲜有报道。那么dmPFC是否可以下行投射到腹外侧中脑导水管周围灰质(vlPAG,与PAG内的其他亚核相比,被认为与疼痛调控更加密切)而参与慢性痛的下行调控呢?为解决这一系列问题,我们开展了此项研究。本项研究综合运用多种形态学方法证明dmPFC-vlPAG神经通路的存在并进行该通路的传入和传出研究;利用化学损毁、光遗传、化学遗传和行为药理学等多种方法全面探讨dmPFC-vlPAG神经通路在慢性痛和负性情绪中的作用。故,本论文分为以下两个部分进行探讨:1、dmPFC-vlPAG神经通路参与慢性痛下行调控的形态学研究目的:证实dm PFC-vlPAG神经通路的存在并进行dmPFC内PV阳性神经元的传入投射研究和vlPAG向RVM的传出投射研究。方法:(1)应用束路追踪的方法分别观察dmPFC向vlPAG的投射、vlPAG向RVM的投射及RVM向脊髓背角的投射,并结合免疫荧光双标或荧光原位杂交的方法探讨了其中投射神经元的化学性质;(2)腺相关病毒感染dmPFC内的锥体神经元后观察病毒感染标记的纤维在vlPAG内的分布和与向RVM投射神经元的位置关系;(3)运用狂犬病毒跨单级突触标记系统分别研究vlPAG内VGLUT2阳性神经元、dmPFC内PV阳性神经元和RVM内5-HT阳性神经元的跨突触投射情况。结果:(1)将逆行示踪剂荧光金(FG)注射到vlPAG后,可在dmPFC内观察到大量的FG标记的投射神经元,所有的神经元与兴奋性神经元的标志物CaMKII免疫共存,且都表达VGLUT1 mRNA而不表达VGLUT2 mRNA和抑制性神经元的标志物GAD67;将顺行示踪剂生物素葡聚糖胺(BDA)注射到dmPFC后,可在vlPAG内观察到大量的顺行标记的纤维;将AAV2/2-CaMKIIα-EYFP注射到dmPFC后,同样在vlPAG内观察到大量的EYFP标记的神经纤维;运用狂犬病毒跨单级突触标记系统,将狂犬病毒3联病毒注射到VGLUT2-Cre小鼠的vlPAG后,可在dmPFC内观察到dsRed跨突触标记的向vlPAG中VGLUT2阳性神经元投射的神经元。(2)同样将狂犬病毒3联病毒注射到PV-Cre小鼠的dmPFC内,可在前扣带回(ACC)、内侧前额叶皮层(mPFC)、岛叶(IC)、屏状核(CLA)等皮层结构,丘脑室旁核(PVT)、丘脑带旁核(PT)、丘脑内侧背核(MD)、丘脑中央外侧核(CL)、丘脑菱形核(Rh)和丘脑reuniens核(Re)等丘脑核团,终纹床核(BNST)、杏仁核基底外侧部(BLA)及尾侧海马(HIP)观察到dsRed跨突触标记的向dmPFC中PV阳性神经元投射的神经元。(3)在将狂犬病毒3联病毒注射到Sert-Cre小鼠的RVM后,可在vlPAG内观察到dsRed跨突触标记的向RVM中5-HT阳性神经元投射的神经元;结合荧光原位杂交和免疫荧光双标的方法,可观察到vlPAG内向RVM投射的神经元中有超过90%的神经元表达VGLUT2且在脊髓背角注射FG后RVM中可观察到FG标记的向脊髓投射的5-HT阳性神经元接受VGLUT2阳性纤维终末的密切接触;分别将AAV2/2-CaMKIIα-EYFP注射到dmPFC,将FG注射到RVM后,可在vlPAG内观察到EYFP标记的纤维终末与向RVM投射的FG阳性神经元形成密切接触。结论:dmPFC内含VGLUT1的兴奋性锥体神经元投射到vlPAG内的VGLUT2阳性神经元形成兴奋性的神经通路,这一通路可以通过从vlPAG发出的VGLUT2阳性的纤维终末正向调控RVM内的5-HT神经元,从而形成从皮层到脊髓Top-Down的下行调控神经通路。同时,dmPFC内的抑制性中间神经元可以接受许多传递痛相关信息核团的密集投射。2、dmPFC-vlPAG神经通路参与慢性痛下行调控的机能学研究目的:通过多种方法沉默或兴奋dmPFC-vlPAG神经通路,观察对动物痛行为及其相关焦虑样行为的影响,并初步揭示dmPFC参与慢性痛可能的分子机制。方法:(1)建立腓总神经结扎(CPNL)慢性神经病理性痛模型,而后进行痛行为和焦虑样行为的检测;(2)运用Von Frey纤维丝测定双侧后足的机械性痛阈值,旷场和高架十字迷宫检测动物的焦虑样行为;(3)注射海人藻酸(KA)毁损dmPFC,光遗传学方法激活dmPFC-vlPAG神经通路或运用化学遗传性方法特异性兴奋dmPFC内的Vgat阳性神经元,观察对动物痛行为及其相关焦虑样行为的影响;(4)Western blot检测慢性痛后dmPFC内GABAAR和mGluR1的表达,通过行为药理学的方法dmPFC内局部给予两种受体的特异性拮抗剂观察对痛行为及其相关焦虑样行为的影响。结果:(1)将KA注射到双侧的dmPFC对其化学毁损后,不仅可降低正常小鼠的疼痛阈值,还可显著减少其在旷场内的活动总路程和旷场中央区活动时间百分比以及小鼠在高架十字迷宫内开放臂停留时间百分比和进入开放臂次数百分比;对化学毁损双侧dmPFC的小鼠进行CPNL后,同样可降低小鼠的机械性痛敏,增加小鼠对非伤害性刺激的反应次数,但与单纯CPNL小鼠相比并未观察到其在旷场内和高架十字迷宫内的行为学改变。(2)将AAV2/2-CaMKIIα-hChR2-EYFP注射到dmPFC内后,将光纤置于vlPAG的上方,给予蓝光刺激(10 mW,20 Hz)时可显著的提高小鼠CPNL术后7天双侧后足的机械性缩足反射阈值;同时可明显增加小鼠CPNL术后14天在高架十字迷宫内开放臂停留时间百分比和进入开放臂次数百分比,但对小鼠在旷场内的行为学无明显影响。(3)将AAV2/4-hSyn-DIO-HA-hM3Dq-mCitrin注射入Vgat-Cre小鼠双侧dmPFC内,腹膜腔注射CNO 1 mg/kg后30分钟进行行为学测试,不仅可降低正常小鼠的疼痛阈值,还可显著减少其在旷场内的活动总路程和旷场中央区活动时间百分比以及小鼠在高架十字迷宫内开放臂停留时间百分比和进入开放臂次数百分比;同样还可降低CPNL术后7天神经病理性痛后小鼠的机械性痛敏;减少CPNL术后14天小鼠在旷场内的活动总路程,进一步降低其在旷场中央区活动时间百分比以及小鼠在高架十字迷宫内开放臂停留时间百分比和进入开放臂次数百分比。(4)小鼠CPNL术后7天Western blot检测观察到dmPFC内GABAAR和m GluR1的表达显著增加;通过行为药理学的方法将套管置于dmPFC局部给予GABAAR和mGluR1的特异性拮抗剂bicuculline和LY367385,均可显著的改善小鼠CPNL术后7天双侧后足的机械性痛敏;同时可明显增加小鼠CPNL术后14天在旷场内的活动总路程和旷场中央区活动时间百分比以及在高架十字迷宫内开放臂停留时间百分比和进入开放臂次数百分比。结论:dmPFC-vlPAG神经通路参与了维持小鼠正常情况下疼痛的阈值及在旷场和高架十字迷宫内的行为。毁损双侧dmPFC或特异性兴奋dmPFC内的抑制性神经元间接沉默dmPFC-vlPAG神经通路,可降低动物正常时和慢性痛时的机械性痛阈值,增加动物对机械性刺激的反应,导致动物焦虑样负性情绪的产生,兴奋dmPFC内的抑制性神经元还可恶化慢性痛所致的负性情绪。而兴奋dmPFC-vlPAG神经通路可产生镇痛作用,并可改善慢性痛后的负性情绪。慢性痛时dmPFC内GABAAR和m GluR1表达的上调能够抑制dmPFC-vlPAG下行镇痛通路,参与了慢性痛的发生、发展及负性情绪的形成。