论文部分内容阅读
背景和目的先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）是在胚胎发育时期由于心脏和大血管形成障碍或发育缺陷而诱发的先天性疾病,除解剖结构异常外,也伴随着心脏发育相关基因表达的异常。作为哺乳动物发育过程中首个形成的功能性器官,心脏由中胚层衍生而来,其前侧板中胚层的区域一旦受到向心肌特异分化的“指令”,则形成新月形生心区（Cardiac crescent）。随后生心区发育成直心管,直心管继续延长并向右扭转,由此形成原始心房心室,在此基础上,具有四个腔室的心脏和传导系统得以形成。这一过程中心脏特异转录因子NKX2.5（NK2homeobox 5）、GATA4（GATA binding protein 4）、MEF2C（Myocyte enhancer factor 2C）和TBX5（T-box 5）等发挥重要的调节作用,同时表观遗传修饰如DNA甲基化和去甲基化、组蛋白甲基化、泛素化、乙酰化以及非编码RNA等也在精确地调控心脏相关基因的表达,影响心脏发育。研究表明,组蛋白修饰与心脏相关基因表达的调控密不可分。其中,组蛋白H3赖氨酸甲基化修饰能够通过改变染色质结构的紧密或疏松状态,调控基因的激活或沉默,而组蛋白甲基化修饰主要是由组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶调控。其中,组蛋白去甲基化酶KDM5C（Lysine-specific histone demethylase 5C,KDM5C）和KDM5D能与心脏相关转录因子相互作用进而影响心脏发育。目前,KDM5A作为KDM5C、KDM5D同一家族的成员之一,其研究主要集中在肿瘤领域,而在心脏发育中的功能尚未阐明,鉴于此,开展了本课题的研究。本课题旨在探索组蛋白去甲基化酶KDM5A在小鼠心脏发育过程中发挥的作用及机制,以期为先天性心脏病的防治提供新的思路及靶点。方法1分析敲除KDM5A对小鼠心脏发育的影响选取适龄KDM5A+/-杂合子小鼠进行交配,获得E12.5（Embryonic12.5）和E15.5天的KDM5A+/-杂合子和同窝野生型（KDM5A+/+）小鼠胚胎。通过马松染色观察两组小鼠胚胎心脏形态,并提取胚胎心脏RNA,通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证KDM5A在两组心脏中的表达。2分析胚胎期小鼠心脏中KDM5A对心肌细胞增殖能力的影响在KDM5A+/-杂合子和野生型小鼠胚胎心肌细胞中,通过q RT-PCR检测Cdkn2b（Cyclin dependent kinase inhibitor 2B）的表达水平;免疫组化检测p H3（Phosphorylated histone H3）和细胞周期蛋白cyclin D1的表达水平。3分析KDM5A在小鼠心脏发育过程中的分子机制在KDM5A+/-杂合子和野生型小鼠胚胎心脏中,通过免疫组化检测H3K4me2和H3K4me3的水平,以及心脏发育重要转录因子GATA4的表达。4分析KDM5A对小鼠胚胎干细胞E14TG2a向心肌细胞分化的影响构建稳定敲除KDM5A的E14TG2a细胞株,随后诱导其向心肌细胞分化,以未敲除的E14TG2a细胞作为对照,分析敲除KDM5A对E14TG2a细胞向心肌细胞分化的影响。5分析KDM5A在E14TG2a细胞向心肌细胞分化中的分子机制qRT-PCR检测向心肌细胞分化中KDM5A敲除组和对照组在第2、4、10天中内胚层和中胚层标志物以及心脏特异性基因的表达。结果1在E12.5和E15.5天,KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎心脏呈现发育迟缓和心室壁变薄的现象,并且在E15.5天,KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎体型明显小于同窝野生型（KDM5A+/+）胚胎。2 KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎心肌细胞中pH3和cyclin D1的表达量减少,而Cdkn2b上调。3 KDM5A+/-杂合子小鼠胚胎心肌细胞中H3K4me2水平未发生明显变化,而H3K4me3水平明显增高,心脏发育重要转录因子GATA4的表达水平降低。4在E14TG2a细胞向心肌细胞分化过程中,如果敲除KDM5A则导致分化过程受到抑制。5 KDM5A敲除后,与对照组相比,在诱导分化第2天,GATA4和GATA6表达水平降低,内胚层特异基因SOX7（SRY-Box transcription factor 7）表达水平降低;第4天,中胚层标志物Brachyury和Bmp7（Bone morphogenetic protein 7）表达水平降低,内胚层特异基因SOX7表达水平增高,WNT信号通路中重要蛋白Wnt3（Wingless-type MMTV integration site family,member 3）表达水平降低。结论1在小鼠胚胎发育过程中,组蛋白去甲基化酶KDM5A敲除抑制小鼠心脏发育,使心脏发生心肌致密化不全,其机制是KDM5A敲除后通过抑制GATA4的表达,进而抑制细胞周期蛋白cyclin D1的表达,抑制心肌细胞增殖。2在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中,KDM5A敲除抑制胚胎干细胞向中胚层以及之后的心肌分化,其机制是KDM5A敲除后抑制了WNT信号通路中Wnt3的表达,从而抑制心肌分化。