大肠杆菌是哺乳动物和禽类肠道内正常菌群之一,大部分大肠杆菌没有致病性,然而少数大肠杆菌对人和动物具有致病性。根据毒力因子、发病机制及病变的不同,将致病性大肠杆菌分为肠道致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic E. Coli)和肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC)。肠道外致病性大肠杆菌主要属于大肠杆菌B2进化群,包括尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E. coli, UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis E. coli, NMEC)和禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic E. coli, APEC)。人的ExPEC能感染人,引起尿道感染和新生儿脑膜炎。另外APEC还可引起禽类的大肠杆菌病,对养禽业造成巨大的损失。APEC和NMEC在基因组结构上很相似,且具有很多相同的毒力因子,如P菌毛、Ⅰ型菌毛、荚膜、铁摄取系统、侵袭素IbeA等。越来越多的试验提示APEC是人ExPEC (NMEC和UPEC)的毒力基因的贮库。因此,加强对我国禽致病性大肠杆菌的长期监测和研究,对养禽业和公共卫生具有重要意义。尽管致病微生物的致病机理不同,但是大部分致病菌致病都利用黏附和侵袭机制穿透宿主细胞的屏障,从而逃避机体的清除。定殖是病原菌的致病力的关键,在细菌感染并引起疾病的早期发挥重要的作用。病原菌的黏附能力是细菌成功定殖的关键,黏附素是病原菌重要的毒力因子,通过结合相应的特异性受体将细菌定殖于宿主细胞表面,在黏附过程中发挥重要的作用。细菌定殖后开始大量繁殖,随血液循环进入各个组织器官。大部分病原菌需要穿透机体屏障,从而引起疾病,侵袭相关蛋白在细菌的侵袭过程中发挥重要作用。1.禽致病性大肠杆菌DE205B自分泌黏附素AatA的致病作用自分泌黏附素基因aatA是通过抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)方法鉴定的APEC新基因,尚待深入研究。本研究分析APEC自分泌黏附素基因aatA的序列及其在779株不同致病性大肠杆菌中的分布,并利用Red同源重组系统构建APEC DE205B的aatA基因缺失株和互补株。通过比较野生株、缺失株和互补株的致病力、体外和体内黏附能力、凝集性及毒力基因表达水平,阐述自分泌黏附素AatA在APEC致病过程中发挥的作用。序列分析结果表明,aatA开放阅读框为3498 bp,编码的自分泌黏附素AatA具有自分泌蛋白家族的特性,包括信号肽区、自分泌重复序列、膜外功能区和跨膜区。流行病学调查结果表明,aatA在大肠杆菌中的分布率为23.9%,且在致病性大肠杆菌及非致病性大肠杆菌中均有分布,可能是aatA通过其上下游插入序列及转移酶在不同菌株之间水平转移所致。aatA主要分布于禽类,在禽致病性大肠杆菌中的分布率最高(32.7%)。结合大肠杆菌进化群和多位点序列(MLST)分析,确定aatA主要存在于大肠杆菌D进化群和STC93、ST140、ST117菌株。构建的aatA基因缺失株和互补株具有较好的遗传稳定性,但缺失株生长能力稍低于野生株。凝集试验表明自分泌黏附素AatA有助于细菌的凝集及沉降,但是Ⅰ型菌毛可以抑制其凝集作用。黏附抑制试验结果表明,自分泌黏附素AatA及其免疫血清能够抑制APEC对DF-1细胞和HEp-2细胞的黏附。缺失株的体外及体内黏附能力低于野生株,且毒力基因表达水平下调,导致其对雏鸭及小鼠的致病力降低。而互补株的黏附能力、毒力基因表达水平及致病力都显著高于缺失株,提示自分泌黏附素AatA是APEC重要的毒力因子,介导APEC对细胞的黏附。2.禽致病性大肠杆菌DE205B侵袭素IbeA的致病作用侵袭素基因ibeA位于脑膜炎大肠杆菌毒力岛(Genetic Island of Meningitic E. coli containing ibeA, GimA),在NMEC穿透血脑屏障并引起脑膜炎过程中发挥重要作用,但在APEC致病过程中的具体作用尚不清楚。有必要分析APEC的侵袭素基因ibeA序列及分布,并阐述其在APEC致病过程中的作用机理。APEC DE205B侵袭素基因ibeA开放阅读框为1371 bp,与另外两株禽致病性大肠杆菌APEC_O1和BEN2908以及新生儿脑膜炎大肠杆菌IHE3034的同源性为100%,而与另外一株新生儿脑膜炎大肠杆菌RS218的同源性为99.3%,提示ibeA基因不存在大肠杆菌的致病型特异性。流行病学调查表明,20株APEC含有ibeA基因,分布率为4.30%,且主要分布于大肠杆菌B2进化群。体外侵袭试验结果显示,NMEC和APEC可侵袭鸡胚成纤维细胞DF-1,因此可采用DF-1细胞研究APEC的侵袭机理。利用Red同源重组系统构建APEC DE205B的侵袭素ibeA基因缺失株,ibeA基因缺失株和互补株有较好的遗传稳定性,且二者的生长速度没有明显差异,提示ibeA与APEC的生长繁殖无关。ibeA缺失株的体内及体外侵袭能力显著低于野生株,且互补株的侵袭能力恢复到野生株水平。另外,ibeA的表达使大肠杆菌AAEC189获得了侵袭能力,并且侵袭素IbeA及其免疫血清能够抑制APEC对DF-1细胞的侵袭,提示侵袭素IbeA在APEC侵袭细胞并穿透血脑屏障过程中发挥作用。缺失株的黏附及侵袭相关毒力基因的表达水平下调,可能导致APEC侵袭能力及致病力的降低。生物被膜试验表明,侵袭素IbeA有助于APEC形成生物被膜,可能与细菌的致病力及生存有关。3.禽致病性大肠杆菌DE205B自分泌黏附素基因aatA和侵袭素基因ibeA双基因缺失株的生物特性分析黏附素和侵袭素在APEC黏附、侵袭并穿透血脑屏障过程中发挥重要作用,构建黏附素基因aatA和侵袭素基因ibeA双基因缺失株,研究其生物学特性,为弱毒疫苗的开发提供基础。利用Red同源重组系统,构建aatA缺失株,并成功将抗性基因去除,然后在单基因缺失株的基础上构建aatA和ibeA双基因缺失株。生物特性分析结果表明,双基因缺失株与野生株的生长速度没有明显差异,但双基因缺失株DF-1细胞的黏附及侵袭能力显著低于野生株,分别为野生株黏附率及侵袭率的59%、42%。体内感染试验结果表明双基因缺失株在血液、脑、肺、肝和脾的黏附及侵袭能力分别为野生株的37.2%、10.5%、23.6%、16.1%和63.1%。双基因缺失株在体内及体外黏附侵袭能力低于单基因缺失株,提示aatA、ibeA两个基因通过不同的信号通路发挥作用。致病性试验结果表明,双基因缺失株的致病力明显低于野生株,且低于单基因缺失株,提示其有可能作为弱毒疫苗的候选毒株。4.禽致病性大肠杆菌DE205B毒力岛GimA调控蛋白IbeR的致病作用ibeR基因位于脑膜炎大肠杆菌毒力岛GimA,但在NMEC和APEC致病过程中的作用尚不清楚。分析APEC DE205B的ibeR序列及在APEC中的分布,并比较ibeR基因缺失株、互补株与野生株的生物学特性,从而阐述调控基因ibeR在APEC致病过程中的作用。结果表明,APEC DE205B调控基因ibeR开放阅读框为1950 bp,与其他大肠杆菌的同源性为99-100%。流行病学调查结果表明,4.3%(20/467)APEC中国分离株含有ibeR基因,且主要为大肠杆菌B2进化群,ibeR与其下游基因ibeA在APEC中的分布完全相同。体外及体内侵袭试验结果表明,缺失株的侵袭能力明显低于野生株,可能导致APEC致病力下降,提示调控蛋白IbeR参与APEC对宿主细胞的侵袭。