构建SOSS1复合物各亚基敲除的稳定细胞系及SOSSB1参与HR修复的分子机制研究

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:abcchencj
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目的:本研究旨在使用新型基因敲除技术,即CRISPR/Cas9n技术构建敲除SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因的稳定细胞株,为深入研究SOSS相关蛋白功能提供体外敲除细胞模型。基于SOSSB1敲除的稳定细胞株研究SOSSB1复合物中SOSSB1亚基在HR中的具体作用机制。方法:使用加利福尼亚大学基因组网站确定靶标DNA的外显子和内含子序列及分布,利用麻省理工学院的CRISPR靶序列设计网站针对单个外显子逐一进行序列比对筛选,定位合乎要求的靶标特异的导向RNA(Single guide RNA,sgRNA),筛选评分较高的sgRNA序列,在5’端加入特异的粘性末端接头设计引物,除两端接头不同外,正向引物与反向引物互补,以用于退火后插入带有与之末端互补的PX462载体。CRISPR/Cas9n双切口酶技术与传统的CRISPR/Cas9区别是产生两对序列相近的sgRNA,此操作增加了靶向序列的长度,从而有效的降低脱靶效应的产生。为增加后期试验的可靠性,针对每个基因分别设计了两组不同的sgRNA序列,分别靶向不同外显子。利用BbsⅠ限制性内切酶对PX462质粒进行单酶切从而得到线性化的PX462载体。分别退火合成好的正反向引物,在T4连接酶作用下,退火序列与PX462线性载体相连接,构建能靶向剪切目的基因的重组真核表达质粒。重组真核质粒经单酶切和相应的测序鉴定后,每组(上下游,两个)重组载体共转染到HeLa细胞中,使用相应浓度的嘌呤霉素筛选阳性细胞,挑选并培养单克隆细胞,使用Western blot实验鉴定是否有敲除效果,并使用相同的方法处理293T细胞,验证其是否具有重复性。使用构建好的细胞株,经过相应的DNA损伤试剂的诱导构建DNA损伤的细胞模型,对其进行免疫荧光实验、DNA损伤敏感实验、细胞周期实验以及与其他蛋白的相互作用验证其在HR中的作用机制。结果:针对SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因每个外显子进行序列比对,设计出多组针对不同基因相应靶位点的sgRNA序列,每个基因筛选2组评分高的sgRNA序列。对插入sgRNA序列的PX462重组载体酶切鉴定,并结合DNA测序分析,结果表明各基因的sgRNA序列均插入PX462载体,成功带有靶向性的PX462重组载体。分别将靶向到各个基因的PX462-sgRNA--A和PX462-sgRNA-B重组质粒共转染入HeLa细胞,以等量的PX462空载体和不含嘌呤霉素抗性的质粒细胞作为对照,使用2μg/mL的嘌呤霉素筛选,将存活的细胞稀释成单个细胞继续培养,培养成肉眼可见单克隆细胞簇后挑出,继续扩大培养,用于细胞传代培养及Western blot检测。Western blot结果显示,与对照组相比,敲除组中的未检测出SOSSB1、SOSSB2和SOSSC蛋白的表达,SOSS基因敲除的HeLa细胞株构建成功。同样,在293T细胞中,与对照组相比,敲除组中的未检测出SOSSB1、SOSSB2和SOSSC蛋白的表达,SOSS基因敲除的293T细胞株构建成功。SOSSB1敲除的细胞对细胞周期并无影响,但其可以影响RAD51重组酶的招募,细胞损伤敏感性实验表明SOSSB1亚基缺失会使细胞对DNA损伤的敏感性增加,同时可以使ATR激酶通路中的CHK1和CHK2磷酸化水平降低。结论:本研究使用新型CRISPR/Ca9n技术成功构建出敲除SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因的HeLa细胞株和293T细胞株,该基因敲除细胞模型的构建为后续SOSS基因功能的研究奠定了基础。SOSSB1亚基对DNA损伤的细胞周期并无影响,但其可以影响RAD51重组酶的招募,参与HR中ATR激酶下游蛋白的磷酸化修饰。
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