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氢能具有燃烧热值高和产物无污染的特点,因此氢能被认为是最具有开发潜力的清洁能源之一。
Rhodospirillumrubrum为紫色非硫光合细菌,能够利用太阳在固氮酶作用下催化放氢;但是固氮酶对光的依赖和吸氢酶对氢气的吸收是R.rubrum在光暗交替条件下持续放氢限制因素。
为了提高R.rubrum的放氢产量和阐明R.rubrum在持续光照条件下的氢代谢途径,本论文通过缺失突变构建了6个R.rubrum突变株,分别为:吸氢酶大亚基结构基因hupL缺失单突变株R.rubrumUR801,nifHhupL双突变株UR803,draTGBhupL双突变株UR805,吸氢酶正调节因子hupR缺失单突变株UR811,Fe-固氮酶结构基因anfDG缺失单突变株UR802以及nifHanfDG双突变株UR804;并构建了丙酮丁醇梭菌Fe-氢酶基因在R.rubrum中的表达菌株。
苄基紫精还原法测定R.rubrumUR2,UR801与UR811的吸氢酶活性,表明hupL或hupR的突变使吸氢酶活性明显降低,而且吸氢酶活性的节律性消失;但是hupR突变株的吸氢酶活性比hupL突变株的吸氢酶活性高,表明hupR突变后,吸氢酶还存在本底水平的表达。
在固氮条件下,测定所构建R.rubrum突变株与野生型菌株的固氮酶活性,结果表明:吸氢酶大亚基基因hupL或Fe-固氮酶结构基因anfDG的缺失并不影响R.rubrum的细胞乙炔还原活性与细胞生长,但是Mo-固氮酶的结构基因nifH的缺失导致细胞乙炔还原活性的下降,为R.rubrumUR2固氮酶活性的5-7%。
比较了R.rubrumUR2(WT),UR801,UR472(△draTGB::kan)与UR805在持续光照条件下产生气体的氢气含量,结果表明在在培养的30-80小时内,四个菌株的氢含量都大于80%,但是hup+菌株(R.ruburmUR2与UR472)的氢含量随着培养时间的增加逐渐降低,而hup-菌株(UR801与UR805)的氢气含量没有显著的下降(>90%),表明hup-菌株产生的氢气更纯。
光照强度对R.rubrumUR2的氢产量影响较小,但是对hupL缺失突变株的氢产量有显著的影响。R.rubrumUR801的氢产量随着光照强度的增加而增加,其光合放氢的饱和光照强度为40000-60000lux。在饱和光照强度下,hupL的缺失能够提高R.rubrum光合氢产量,在改良MG培养基中,其氢产量为R.rubrumUR2的1.56倍(在MG培养基中,其产量为R.rubrumUR2的3倍)。在光暗交替条件下(模拟自然条件),R.rubrumUR805的氢产量最高,为相同条件下R.rubrumUR2氢产量的1.35倍,该菌株有望作为自然条件下的工业产氢菌株。
在持续光照条件下,R.rubrum放氢途径有Mo-固氮酶,Fe-固氮酶和第三种途径,但主要放氢由Mo-固氮酶催化,吸氢主要由吸氢酶介导。
丙酮丁醇梭菌Fe-氢酶在R.rubrum中表达并不影响细胞的生长,但是也没有明显地提高光照条件下R.rubrum的氢产量;Fe-氢酶在R.rubrum的超表达影响了R.rubrum细胞的生长,产氢能力也显著下降,表明丙酮丁醇梭菌Fe-氢酶表达菌株并不适用于光合放氢。