背景1:缺血一再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,I-R）是一种常见的病理生理现象,可见于冠心病、心肌梗塞、脑梗塞等多种心脑血管疾病。在I-R时伴随着血管内皮炎症的发生和发展,在血管内皮炎症的发生过程中,包含着大量炎症介质与粘附分子的分泌。大量研究表明,急性炎症时,P-选择素分泌表达增加,如果我们能够采用无创的影像学方法判断这些粘附分子的变化,无疑将会具有极其重要的临床价值。靶向超声分子成像（targeted ultrasound molecular imaging）是目前国际上影像学技术领域正在探讨的前沿热点,它是依靠微泡表面固有的特性或通过对微泡进行特殊处理,使微泡能滞留在特殊的组织和器官的一种新技术。靶向超声分子成像有可能在以下两方面拓展传统超声微泡技术的应用范围,其一是发展一种无创性评价各种病变组织和器官的分子学图像,如血管内皮损伤、血栓形成、血管新生和肿瘤等;其二是可能为基因和药物的定向释放提供新的技术支持。近年来,国外已成功地应用携带P-选择素单抗的微泡造影剂评价心脏、肾脏I-R损伤,显示了靶向超声分子成像评价炎症反应的良好前景。然而,国内的靶向分子成像技术的研究尚无实质性进展。外周血管动脉粥样硬化是冠心病的等危症,可导致跛行、坏疽等并发症,并可导致肢体I-R损伤。随着外周动脉粥样硬化性疾病发病率的增加,早期发现下肢I-R损伤对减少上述并发症有着重要的意义,故一种无创的早期检查骨骼肌I-R损伤的方法是十分重要的。目前应用靶向超声分子显像技术对心肌、肾脏I-R损伤评价的研究较多,而下肢的局部血流量要远远小于心脏及肾脏,炎症靶向微泡造影剂是否能评价肢体骨骼肌的I-R损伤尚不十分清楚,国内并无相关文献报道。因此,本研究在普通脂质微泡的基础上,通过“抗生物素蛋白/生物素复合体”（Avidin-biotin）的化学桥接作用（bridging chemistry）将抗小鼠P-选择素单克隆抗体连接于脂质微泡外壳构建了携带抗P-选择素单抗靶向微泡（MBp）,在建立小鼠下肢骨骼肌I-R损伤模型后,应用MBp和普通脂质微泡（无携带抗P-选择素单抗的脂质微泡,MB）行对比超声检查,目的在于探讨MBp结合CEU早期评价小鼠下肢I-R损伤的可行性。背景2:血栓性疾病近年来发病率较前明显增加,国内统计,自2001年来,脑梗塞、冠心病、心肌梗死一直在疾病死亡排位中位居前4位,据世界卫生组织2002年的统计,每年大约有1700万人死于各种心脑血管疾病。血栓形成或栓塞是导致心脑和外周血管事件的最后关键环节,是致死和致残的直接原因,没有血栓就没有事件。故血栓性疾病的早期诊断与治疗对减少死亡率及改善预后是极其重要的一环,但目前的一些检查方法如CT、MRI等均存在着一些缺陷。超声开始只是作为一种对血栓性疾病的诊断方法,但近年来,人们发现,超声也有溶栓的作用。随着靶向微泡造影剂的出现,超声结合微泡在血栓性疾病的诊断和治疗中的作用正越来越得到人们的重视。目前超声结合微泡溶栓治疗多还处于基础研究及动物实验阶段,然而,既往的一些制备动物微循环血栓模型的方法较复杂,不易成功,且血管完全闭塞,不能满足血栓靶向微泡微循环实验的要求。本研究采用静脉注射不同剂量的光敏剂制备大鼠提睾肌微循环血栓模型,使其能用于评价溶栓效果及血栓靶向微泡的微循环实验。目的:第一部分:探讨自制的P-选择素靶向微泡结合对比超声在小鼠骨骼肌早期I-R中的诊断价值。第二部分:通过光化学法建立一种新的和临床病理机制相似的大鼠提睾肌微循环血栓模型,可用于血栓靶向微泡造影剂的微循环实验。方法:第一部分:各种相关脂质材料按一定质量比例75℃水浴溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷（C₃F₈）气体,超声振荡至形成乳白色液体制备普通脂质微泡或生物素（biotin）化脂质微泡。生物素化脂质微泡经静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合脂质纯化4次后,按一定比例加入抗生蛋白链菌素（streptavidin）。继续静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗生蛋白链菌素纯化微泡2次后,按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-选择素单克隆抗体（biotinconjugated rat anti-mouse P-selectin monoclone antibody）,最后静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗体纯化微泡2次,冰箱中4℃保存备用。采用库尔特计数仪测量靶向微泡的平均粒径及浓度。采用绿色荧光标记的二抗与抗P-选择素单抗结合,荧光显微镜下观察抗P-选择素单抗与微泡的连接情况。将小鼠用水和氯醛（0.6ml/100g）麻醉后,穿刺尾静脉后留置套管针,钝性分离出股动脉,用动脉夹将其夹闭,1小时后松开。再灌注1小时后,对所有实验小鼠行MB和MBp的下肢对比超声检查。CEU采用经静脉微泡弹丸式注射法进行,每只小鼠采用微量进样器经尾静脉随机（间隔30min）注射普通脂质微泡和靶向微泡数量均为约5×10⁶个。经过10min循环时间待血池中循环微泡完全消失后对下肢骨骼肌进行CEU检查,获取实验小鼠缺血再灌注骨骼肌及正常骨骼肌显影图像,全部声学造影图像存于MO盘,以备脱机分析,实验结束后处死小鼠,取两侧下肢骨骼肌,10%甲醛固定,行病理学检查。采用CEU软件分析靶向对比超声图像,制作彩色编码图应用CEU软件对图像进行分析,评价实验小鼠下肢骨骼肌显影的声强度（video intensity,Ⅵ）,第一帧CEU图像的Ⅵ值代表微泡在骨骼肌组织的滞留浓度,采用彩色编码技术制作骨骼肌显影的彩色编码图像。使用SPSS11.5软件进行统计学分析,所有数据均以（?）±s表示,两组数据间的比较采用独立样本t检验。差异性检验水准设为P＜0.05（双侧）。第二部分:将15只SD雄性大鼠随机分为5组,将大鼠以13.3%乌拉坦+1%氯醛糖溶液（0.6ml/100g）臀部肌肉注射麻醉。分离一侧股静脉,插入连接有三通的聚乙烯导管（PE50,内径0.58mm）。将大鼠右侧阴囊皮肤剪开,剥离睾丸后暴露提睾肌,沿提睾肌对侧血管大分支较少的位置剪开,完整剥下提睾肌,并将睾丸及副睾送还腹腔,将提睾肌固定于操作台的玻片上。经股静脉插管注射5%异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐（MW 15000,6ml/kg）,5分钟后用装有100瓦汞灯的落射显微镜灯经紫外滤光片（450—490nm）对提睾肌微血管行局部照射,同时在显微摄像系统观察血栓形成的情况和测量不同时间点血管的狭窄程度,然后取材行病理学切片检查。所有数据均应用SPSS11.5统计软件分析,所有数据均以（?）±s表示,各时间点间狭窄程度比较用单向方差分析（One-way ANOVA）,各剂量组内狭窄程度比较用重复测量方差分析,剂量与时间之间是否存在交互效应用重复测量的方差分析。差异性检验水准设为P＜0.05（双侧）。结果:第一部分:1、采用库尔特计数仪测得MB平均粒径为2.83um,浓度约为1.5×10⁹个/ml。MBp分布基本均匀,采用库尔特计数仪测得其平均粒径2.73um,浓度7.1×10⁸个/ml。2、MBp制备后,采用绿色荧光标记的二抗与抗P-选择素单抗结合,荧光显微镜下观察显示MBp呈明显绿色荧光,表明生物素化抗P-选择素单抗可通过抗生物素蛋白（抗生蛋白链菌素）与生物素化脂质微泡有效连接。3、MBp的第一帧CEU图像显示IR组缺血再灌注下肢骨骼肌可见显著的超声显影,而未缺血组骨骼肌无明显的超声显影;MB的第一帧CEU图像在IR组缺血再灌注骨骼肌可见轻度的超声显影,其显影强度较MBp的IR组缺血再灌注骨骼肌明显减弱,而MB的第一帧CEU图像在未缺血组骨骼肌中无明显的超声显影。4、MB的Ⅵ值在IR组及未缺血组有显著性差异（P＜0.05）,MBp在IR组的Ⅵ值较未缺血组显著增强（P＜0.05）;两种造影剂在未缺血组的Ⅵ值无显著性差异（P＞0.05）,而MBp在IR组的Ⅵ值明显高于MB（P＜0.05）。5、下肢骨骼肌病理检查示未缺血下肢骨骼肌细胞形态正常,无充血、水肿;IR组骨骼肌细胞水肿,内有大量中性粒细胞浸润。第二部分:1、注射剂量及荧光照射时间与狭窄程度的关系:5组中除0.2ml组外,其它4组血管均在30分钟内完全闭塞,0.4ml～0.6ml组的血管完全闭塞时间较0.3ml组显著减少（P＜0.01）,但0.4ml～0.6ml组之间无显著性差异（P＞0.05）。血管闭塞后30分钟均无自溶。2、显微镜下血栓形成过程:靶血管血流在荧光照射前正常,血流速度很快,呈线流,注射FITC-dextran 0.4ml,荧光照射后最先出现内皮细胞肿胀、收缩,血管壁增厚,血流中的白细胞移向血管壁并附壁翻滚,最终粘附于血管壁,形成“白微栓”;红细胞凝集成团块状,血流速度逐渐变慢,随着照射时间的延长,血栓范围逐渐增大,可见到血栓栓子脱落,随血流前行,最后靶血管完全闭塞,血流停止。但未照射部位的血管血流正常。3、病理学检查示微血管内有血栓形成,内皮细胞肿胀,血栓为红血栓。结论:第一部分:1、我们成功的采用“抗生物素蛋白/生物素复合体”将大鼠抗小鼠P-选择素抗体与普通脂质微泡相结合制备成P-选择素单抗靶向微泡。2、P-选择素靶向微泡造影剂结合对比超声可有效评价骨骼肌I-R的早期炎症反应,将可用于评价微血管炎症或相关的血管内皮反应。第二部分:静脉注射FITC-dextran经光化学法建立大鼠提睾肌微循环血栓模型是一种简单、可靠的方法。在注射0.2ml时血管不会完全闭塞,其形成机制与临床病理机制相同,在荧光活体显微镜下可观察血栓形成的全过程,为血栓靶向微泡的微循环实验提供了一个新的方法。注射0.3ml以上时微血管可完全闭塞,可用于观察药物溶栓效果的实验。