论文部分内容阅读
小麦(Triticum aestivum L.)是世界三大粮食作物之一。农杆菌介导的遗传转化是小麦基因功能研究的主要手段,但较低的植物再生能力限制了高效遗传转化体系的建立,阻碍了小麦功能基因组学分析和基因工程育种的有效开展。建立高效的再生体系对于小麦高效遗传转化和基因功能研究具有重要意义。本研究从小麦中克隆了转录因子LEAFY COTYLEDON 1(LEC1)和LEC2的同源基因并进行了进化树和时空表达模式分析,进而对该基因在小麦中的生物学功能进行了研究。主要结果如下:本研究用拟南芥LEC2的全长氨基酸序列,在Ensembl Plants数据库中进行BLAST检索。结果表明,TaLEC2基因位于3号染色体上。以中国春和Fielder的胚为材料,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆获得了三个TaLEC2基因,分别命名为TaLEC2-3A、TaLEC2-3B和TaLEC2-3D,它们分别编码248、405和301个氨基酸,含有B3结构域。系统进化树分析发现,TaLEC2s与拟南芥的LEC2在同一分支上。亚细胞定位结果显示,TaLEC2蛋白均定位在细胞核内。qRT-PCR分析结果显示,TaLEC2基因在中国春小麦的胚、二棱期茎尖和小穗原基等均有不同程度的表达,尤其在胚中的表达水平最高。原位杂交实验结果表明,TaLEC2s在中国春小麦不同发育时期的胚中均特异表达,在早期籽粒的种皮和胚乳中亦有较高水平的表达。利用同样的策略获得了TaLEC1的序列信息。结果表明,中国春小麦中与拟南芥LEC1相似性最高的基因位于6A、6B和6D染色体上。以中国春和Fielder的胚为材料,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆得到了三个TaLEC1s基因,将其分别命名为TaLEC1-6A、TaLEC1-6B和TaLEC1-6D。三个TaLEC1均编码246个氨基酸,含有HAP3结构域。系统进化树分析发现,TaLEC1s与水稻的OsLEC1在同一分支上且同源性较高。亚细胞定位结果显示,TaLEC1蛋白定位在细胞核中。qRT-PCR分析结果显示,TaLEC1s基因在中国春小麦的胚、二棱期茎尖和单棱期茎尖等均有不同程度的表达。原位杂交实验结果表明,TaLEC1s基因在中国春小麦不同时期发育的胚中均特异表达。为了研究TaLEC1和TaLEC2基因在小麦中的生物学功能,我们构建了TaLEC1和TaLEC2的过表达载体、amiRNA载体、雌激素诱导的表达载体以及TaLEC2的反义RNA表达载体,以Fielder小麦的幼胚为受体材料,进行农杆菌的遗传转化。目前已获得TaLEC2-3A-OX、TaLEC2-3D-OX和TaLEC2-3D-DOWN的T2代阳性植株,TaLEC2-3B-OX、amiRNATaLEC2和雌激素诱导表达载体已获得T0代阳性植株。qRT-PCR结果显示,TaLEC2-3A和TaLEC2-3D在过表达转基因植株中表达水平显著上调,TaLEC2的表达水平在TaLEC2-3D-DOWN植株中明显下调。与对照Fielder相比,TaLEC2-3A-OX和TaLEC2-3D-OX转基因小麦植株生长缓慢,株高降低,分蘖减少,籽粒变小,粒重减轻。TaLEC2-3D-DOWN转基因小麦植株健壮,株高增高,分蘖增多,籽粒变长、变宽,粒重明显提高,这表明降低TaLEC2的表达水平可有效促进籽粒增大、显著提高单株产量。形态学和组织学的观察结果显示,过表达TaLEC2-3D促进体细胞胚和胚性细胞的形成和维持。过表达TaLEC1促进胚性细胞的形成和维持。综上所述,在小麦中过表达TaLEC2基因在诱导离体条件下胚性细胞的形成和体细胞胚的发生中具有重要作用,而过表达TaLEC1基因促进胚性细胞的形成和维持。利用反义RNA技术降低TaLEC2s的表达水平可促进小麦籽粒增大,粒重提高。我们首次发现TaLEC2基因是小麦籽粒大小和粒重的负调节因子。研究结果为建立基于体细胞胚再生途径的小麦高效再生体系的建立奠定了坚实的基础,也可利用基因编辑技术人为操控TaLEC2的表达水平进而进行小麦高产育种和分子设计育种提供重要思路和线索。