第一部分:ITP骨髓B细胞微环境失衡及其机制研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）是常见的自身免疫性出血性疾病,以外周血血小板数目减少和出血风险增加为临床特点。ITP的发病机制复杂且具有异质性,主要包括细胞免疫和体液免疫介导的血小板破坏过多,以及巨核细胞成熟障碍引起的血小板生成减少两大类。尽管ITP的诸多异常靶点已经被挖掘,其诊断依然缺乏特异性“金标准”,依赖于排除其他导致血小板减少的原因。同时,仅约2/3的患者对一线治疗反应,相当一部分患者经多线联合治疗仍无效,进展为难治性病例。因此,有必要进一步探究ITP的发病机制,为其精准诊疗提供新的策略。B细胞作为抗体的来源和产生免疫记忆的淋巴细胞,在自身免疫病中的作用不容小觑。一方面,B细胞对自身抗原失耐受后分化为浆细胞产生致病的自身抗体;另一方面,调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）也可以通过其免疫抑制特性发挥抗炎作用。自身反应性B细胞在ITP的发生发展中处于核心地位。前期已有研究表明ITP患者外周血B细胞亚群紊乱,但覆盖群体不全面,趋势也存在争议;关于骨髓的研究多聚焦于T细胞和间充质干细胞,B细胞则鲜有报道。骨髓作为B细胞发育的场所,探究其微环境有助于揭示B细胞分化、趋化以及免疫耐受情况,从而进一步完善ITP的发病机制。研究目的:（1）探究ITP患者骨髓和外周血中总B细胞、各分化阶段B细胞亚群以及浆细胞与健康供者的差异,明确ITP患者存在的B细胞分化发育异常。（2）探究ITP患者骨髓B细胞免疫耐受状态,并利用动物模型验证Breg输注治疗ITP的可行性。（3）探究ITP患者B细胞成熟和趋化相关细胞因子及其受体的表达,分析与B亚群数量和分布的相关性,进一步完善ITP的发病机制。研究方法:（1）标本收集:收集初诊初治的ITP患者以及健康干细胞供者的骨髓和外周血;分离血浆,利用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells,BMMCs）和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。（2）酶联免疫吸附试验:检测血浆趋化因子CXCL13、B细胞活化因子（B cell activating factor,BAFF）、增殖诱导配体（a proliferating inducing ligand,APRIL）和抗血小板膜糖蛋白（CD41a和CD42b）抗体。（3）流式细胞术:检测未成熟B细胞、初始B细胞,记忆B细胞,Breg,浆母细胞,短寿命/长寿命浆细胞,趋化因子受体CXCR5、细胞因子受体BAFF-R、BCMA和TACI的表达。（4）实时荧光定量聚合酶链式反应:留取PBMCs和BMMCs的mRNA,检测B细胞分化相关转录因子的表达;留取免疫磁珠分选后B细胞的mRNA,检测趋化因子受体/细胞因子受体在B细胞中的表达水平。（5）Breg体外功能试验:对B细胞体外加以CD40配体和Toll样受体9（Toll-like receptor 9,TLR9）刺激因子CPG-ODN诱导活化,并分别与同源单核细胞和CD4+T细胞共培养,检测共培养前后单核细胞分泌TNF-α的水平、CD4+T细胞分泌IFN-y的水平以及调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）的分化程度。（6）ITP主动模型构建:利用C57BL/6背景的野生鼠血小板免疫同源CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61-KO）鼠,取免疫好的后者脾细胞腹腔输注给200cGy 辐照过的严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠。（7）Breg体内功能试验:对照组为不加干预的ITP主动模型小鼠;实验组分别为输注野生鼠骨髓Breg的主动模型鼠、输注免疫过的CD61-KO鼠骨髓Breg的主动模型鼠。每周股静脉取血检测血常规,探究Breg对ITP动物模型的影响。研究结果:（1）ITP患者B细胞早期发育异常:与健康供者相比,ITP患者骨髓总B细胞减少,CD127+未成熟B细胞群体占淋巴细胞比例减低;决定B细胞系谱特异性的转录因子Pax5在ITP患者的PBMCs和BMMCs中表达较供者大幅降低。（2）ITP骨髓B细胞亚群分化失衡:ITP患者骨髓中初始B细胞比例较供者降低,记忆B细胞比例增高;二者的浆母细胞和短寿命浆细胞虽无显著差异,但抗血小板自身抗体阳性患者的骨髓长寿命浆细胞较正常人和抗体阴性患者均显著增多。（3）ITP骨髓Breg数量和质量双重缺陷:ITP患者骨髓和外周血CD19+CD24highCD38high Breg数量较健康对照显著减少,其骨髓B细胞分泌免疫抑制性细胞因子白介素10（interleukin 10,IL-10）和转化生长因子β（transforming growth factor β,TGF-β）的能力降低;体外功能试验结果表明,ITP患者骨髓Breg抑制单核细胞和CD4+T细胞分泌促炎因子的能力减弱,诱导Treg分化的能力较供者降低。（4）Breg输注对ITP主动模型鼠的影响:输注免疫过的CD61-KO鼠骨髓Breg的小鼠,在脾细胞输注后第21天和第28天较对照组小鼠血小板数目明显提升;而输注野生鼠骨髓Breg的小鼠,病情无缓解,死亡率更高。（5）ITP患者B细胞活化和趋化环境异常:ITP骨髓和外周血血浆CXCL13、BAFF浓度均显著高于健康供者,APRIL仅在骨髓中升高;ITP骨髓和外周血B细胞表达CXCR5和BAFF-R的蛋白及RNA水平均高于健康供者,而BCMA的蛋白和RNA水平仅在ITP骨髓B细胞中升高,TACI则无显著差异。研究结论:（1）ITP骨髓B细胞亚群紊乱,存在早期发育缺陷,后期过度活化,向终末阶段分化的倾向性较正常人增高。（2）ITP骨髓Breg数量和功能均有损害,致其免疫耐受异常;输注类ITP炎性环境下稳定分化出的Breg有助于ITP模型小鼠病情缓解。（3）ITP患者的CXCL13-CXCR5受体配体相互作用增强,BAFF-APRIL系统异常亢进,致其B细胞活化和趋化异常。第二部分:Bruton酪氨酸激酶抑制剂通过阻断自身抗体介导的血小板破坏治疗ITP的机制研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）是由多种造血细胞功能障碍导致的疾病。患者的临床表现各不相同,轻者可仅有孤立性血小板减少,重者可伴消化道、泌尿生殖道出血,甚至危及生命的颅内出血。多年来糖皮质激素一直是ITP的一线治疗措施,但长期使用不良反应多。近年来,利妥昔单抗和促血小板生成素受体激动剂等二线药物取得了令人瞩目的疗效。然而,由于ITP发病机制的极大异质性,仍有部分患者无效或迅速复发,最终成为难治性ITP。因此,有必要为这些复发/难治性患者探寻新的治疗策略,提高其生存质量。Bruton酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）是定位在胞质的Tec家族非受体型酪氨酸激酶,广泛表达于除T细胞、浆细胞和自然杀伤（natural killer,NK）细胞以外的造血细胞中。BTK参与固有和适应性免疫的多种信号转导,如B 细胞受体（B cell receptor,BCR）通路、Toll 样受体（Toll-like receptor,TLR）通路、G蛋白偶联受体通路和各种细胞因子受体通路,从而与细胞的存活、增殖、分化、凋亡等各项生物学活动密切相关。目前,BTK抑制剂（BTK inhibitor,BTKi）已成熟地应用于淋巴瘤、淋巴细胞白血病等血液系统恶性肿瘤的治疗;随着诸多二代选择性更高的BTKi的研发,其也逐渐成为类风湿关节炎、狼疮性肾炎、多发性硬化等自身免疫病的治疗选择。然而,关于BTK与ITP之间的研究却鲜有。抗血小板膜糖蛋白（glycoprotein,GP）自身抗体介导的巨噬细胞吞噬是公认的ITP的主要发病机制,B细胞作为生成抗体的源头,巨噬细胞作为破坏血小板的执行者,二者是这一通路上最重要的效应器;同时,B细胞和巨噬细胞均表达BTK。因此,我们推测抑制BTK可能通过调节B细胞和巨噬细胞的表型及功能来阻止血小板的破坏。研究目的:（1）探究BTKi能否纠正ITP患者B细胞的免疫失耐受。（2）探究BTKi能否抑制巨噬细胞对血小板的破坏。（3）探究BTKi对ITP动物模型的有效性和安全性,从而为其临床应用打下基础。研究方法:（1）B细胞分选及体外培养:收集活跃期ITP患者外周血,利用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,免疫磁珠分选CD19+B细胞并体外培养;以IgM作为刺激BCR通路的因子,BTKi的浓度梯度设置为1nM、10nM、100nM、1μM,对照组加入等量DMSO;BTKi需在刺激培养前1hr与细胞进行预孵育。（2）B细胞表面标记测定:体外刺激培养24hr后,流式检测B细胞表面一系列活化和共刺激分子的表达,包括CD69/CD86/CD80/CD40/MHC Ⅰ类分子/MHCⅡ类分子。（3）凋亡与增殖检测:体外培养48hr后,收集培养上清待测细胞因子;同时Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡程度。B细胞体外培养72hr后,流式检测其核内增殖蛋白Ki67表达量;或B细胞在培养前预染羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE）,培养 72hr 后流式检测绿色荧光强度。（4）B 细胞分化:IgM 与重组人 CD40 配体（recombinant human CD40 ligand,rhCD40L）共同辅助B细胞向浆细胞分化,培养72hr后流式检测CD27、CD38、CD138的表达量。（5）巨噬细胞体外诱导及Fcγ受体（Fcγ receptor,FcγR）活化:免疫磁珠分选ITP患者外周血CD14+单核细胞,重组人巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human macrophage-colony stimulating factor,rhM-CSF）诱导 7 天为巨噬细胞;按与B细胞相同的药物浓度设置预孵育1hr后加入IgG-Fc抗体刺激4hr,收集培养上清。（6）体外吞噬功能检测:分离正常人血小板,进行5-氯甲基荧光素二醋酸酯（5-chloromethylfluorescein diacetate,CMFDA）染色和 CD41 抗体致敏,并与诱导好的巨噬细胞共培养1hr,流式检测CD61阴性的巨噬细胞内绿色荧光强度。（7）BTKi治疗ITP主动模型鼠:利用野生鼠免疫过的CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61-KO）小鼠和严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠构建ITP主动模型。实验组小鼠按10mg/kg剂量每日灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）混悬的BTKi粉末,对照组小鼠每日灌胃等体积0.5%CMC-Na;每周检测一次血常规,为期4周。造模第2周末检测小鼠血清抗CD61抗体,造模结束后流式检测小鼠外周血、脾脏和骨髓B细胞、浆细胞含量。（8）细胞培养上清及小鼠血清细胞因子检测:收集的上述B细胞及巨噬细胞培养上清,以及分离的ITP主动模型小鼠血清,使用酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测 TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度。研究结果:（1）BTKi抑制ITP患者BCR通路活化标志表达及细胞因子分泌:BTKi在1nM-1μM以剂量依赖性方式抑制CD69在B细胞上的表达,而仅在100nM和1μM时显著抑制CD86的表达;与DMSO处理的对照组相比,BTKi在10nM、100nM、1μM时均显著抑制HLA-DM和HLA-DQ,在100nM和1μM时显著抑制HLA-DP和HLA-DR的表达,但对CD40、CD80和MHCI类分子没有影响。通过对培养上清的检测,发现BTKi能够抑制B细胞分泌TNF-α和IL-6,但对每种细胞因子的最佳作用浓度不同。（2）BTKi促进ITP患者B细胞凋亡,抑制其增殖:对未给予任何刺激的单个核细胞检测,未发现BTKi对其凋亡有显著影响;但BTKi在1nM至1μM均显著增加了 IgM活化的B细胞的早期凋亡和晚期凋亡比例,降低了活细胞的数量。增殖方面,BTKi处理过的B细胞Ki67阳性率降低,CFSE的荧光强度更高,两种方法均证实细胞的增殖受到了抑制。（3）BTKi阻碍ITP患者B细胞分化:与DMSO处理的对照组相比,100nM和1μM的BTKi显著降低了 CD27-CD38双阳性细胞占CD19+B细胞的比例;CD138阳性浆细胞的数量在与1nM-1μM的BTKi培养后均显著下降。（4）BTKi抑制巨噬细胞FcγR介导的吞噬功能和细胞因子分泌:ITP患者单核来源的巨噬细胞在体外对血小板的吞噬随BTKi药物浓度升高而逐渐下降。FcγR活化诱导的促炎因子分泌也被BTKi抑制,其中TNF-α在100nM和1μM时降低显著;IL-6在10nM-1μM时降低显著;而IL-1β最为敏感,1nM-1μM的BTKi以剂量-依赖性方式减少了其生成。（5）BTKi对ITP主动模型小鼠的免疫调节作用:BTKi可早期迅速缓解小鼠血小板减少,并随时间推移扩大与对照组之间的差距,在脾细胞输注后第14天、第21天和第28天,给药组小鼠血小板计数均显著高于对照组。BTKi处理的小鼠血清CD61抗体含量远低于对照组,外周血总B细胞数量降低,脾脏生发中心B细胞数量减少,脾脏和骨髓浆细胞均显著减少。此外,BTKi组小鼠血清促炎因子IL-6和IL-1β较对照组也显著降低,TNF-α有减低趋势但未达统计学差异。研究结论:（1）BTKi能够在体外抑制ITP患者BCR通路活化引起的B细胞增殖、促炎细胞因子分泌、浆细胞分化,而促进B细胞凋亡。（2）BTKi能够在体外抑制ITP患者巨噬细胞FcγR介导的吞噬作用和炎性因子分泌。（3）BTKi可早期迅速提升ITP主动模型小鼠的血小板数,提高其生存率;减少小鼠浆细胞和自身抗体的生成,抑制其验证因子的分泌。第三部分:克隆造血与ITP鉴别诊断、临床特点和治疗预后的相关性研究研究背景:克隆造血（clonal hematopoiesis,CH）是指具有遗传学变异的造血干细胞,经多系分化后形成携带突变的成熟血细胞。CH并非病态造血或恶性扩增,但它具有竞争性扩增优势、造血功能不平衡呈髓系偏倚、分化形成的终末血细胞具有病理性等生物学特征。造血干细胞的衰老和理化毒素、炎症等环境压力共同导致了 CH,并成为多种恶性血液病的病理基础。CH这一概念最初源于一项对女性X染色体失活的研究,二代测序技术的发展推动CH在健康群体、各种良恶性血液病、实体肿瘤、心血管疾病等领域中有了更加广泛的探索。随着人们对CH了解的加深,新的定义也逐渐诞生:不确定潜能的克隆造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential,CHIP）特指无血液肿瘤病史的成人发生的变异等位基因频率（variant allele frequency,VAF）≥ 0.02的恶性血液病相关驱动基因突变。CHIP被认为是更具有临床意义的CH,CHIP携带者每年进展为血液系统恶性肿瘤的风险为0.5%-1%,且全因死亡率增加。原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种至今病因不明的多种免疫紊乱介导的出血性疾病,发病率约为5-10/10万人,其精准诊疗一直是困扰人们的难题,遗传性血小板减少症、不典型的再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）和低增生骨髓增生异常综合征（hypoplastic myelodysplastic syndrome,hMDS）可能与其混淆。目前,CH与ITP之间的关系还未有研究。探究CH在ITP中的流行情况,对其鉴别诊断可能有指导作用;绘制ITP患者的CH突变谱,可能帮助预测疾病严重程度和治疗预后等。研究目的:（1）探究ITP患者CH的患病率,并与其他存在血小板减少的易与ITP混淆的血液病患者比较,揭示CH在ITP鉴别诊断中的作用。（2）明确CH-ITP患者最常见的突变基因和突变类型,绘制ITP患者的CH突变谱,并与其他易误诊疾病的突变情况进行比较。（3）探究ITP患者CH发病的诱因,CH与患者年龄/性别、疾病严重程度、疗效反应等有无相关性,进一步明确CH在ITP预后中的指导作用。研究方法:（1）病例收集:在山东省内8家医院共收集105位ITP患者、128位AA患者和86位hMDS患者的外周血标本,记录患者基本信息及临床特点,并对患者进行随访。（2）DNA提取:利用MagMAXTM DNA多样品提取试剂盒提取患者外周血裂红后总白细胞的DNA,利用NanoDropTM分光光度计对DNA样本进行定量。（3）扩增子测序:选择与髓系恶性血液病发病密切相关的38个基因,进行靶向二代测序;测序平台为illumina MiseqDX PE250,分析软件为fastp,本研究对VAF的检测阈值为1%。（4）数据分析:选择VAF值大于等于2%且小于40%（排除胚系突变可能）的突变列入临床相关分析,结合测序结果与误诊率、患者的年龄性别、病程、疾病严重程度、慢性临床合并症、治疗效果等进行相关性分析。研究结果:（1）本研究经随访筛选,排除误诊患者,剔除VAF＜2%或＞40%的突变患者后,最终入组102位ITP患者、126位AA患者和80位hMDS患者。ITP患者的CH现患率（10.78%）显著低于AA患者（19.05%,比值比5.99,95%置信区间 5.01-7.16,P＜0.001）和 hMDS 患者（68.75%,比值比 20.34,95%置信区间 16.71-24.77,P＜0.001）。（2）性别在本研究中并非任何一种疾病CH的发病诱因,ITP患者和AA患者的CH患病率均随年龄的增加而升高,hMDS患者的CH现患率基本在各年龄段平稳起伏。（3）CH-ITP中同时具有多个突变的患者（9.09%）少于AA（16.67%）和hMDS（23.64%）,年龄越大携带突变个数可能越多;ITP患者突变基因的VAF值显著低于 AA（5.64%±1.80%vs.12.46%±8.27%,P=0.008）和 hMDS 患者（5.64%±1.80%vs.16.41%±11.54%,P=0.002）,且与年龄呈线性正相关趋势。（4）本研究中CH-ITP的突变基因按发生频率排序依次是DNMT3A（54.5%）,TET2（18.2%）,ASXL1（18.2%）,CEBPA（9.1%）;CH-AA 患者最常见的 6 个突变基因分别是 DNMT3A/TET2/ASXL1（16.67%）,BCOR（12.50%）,PIGA（8.33%）,U2AF1（8.33%）;CH-hMDS 患者最常见的 6 个突变基因为DNMT3 A/ASXL1/SF3 B1（18.18%）,U2AF1（10.91%）,TET2（9.09%）,TP53（7.27%）。单碱基突变是所有CH中最多发生的突变类型,其中又以转换最为常见。（5）本研究并未发现CH与ITP患者的各种合并症如高血压、吸烟、糖尿病、脑梗死、抗血小板抗体等具有相关性;CH阳性患者的外周血血小板数较阴性患者有降低趋势但无统计学差异;CH携带者发生严重出血的风险是无CH个体的6.95 倍。（6）与无CH的ITP患者相比,CH阳性者对糖皮质激素的初始反应率较低（54.5%vs.80.6%,P=0.054）;一线治疗失败的患者更有可能对后续二线治疗产生抵抗性,CH 阳性组患者中难治性ITP的比例显著高于非CH组患者（36.4%vs.4.5%,P=0.002）。研究结论:（1）ITP患者CH 阳性率远低于AA和hMDS患者,其突变基因的VAF值也显著小于AA和hMDS患者,因此靶向测序有助于鉴别不典型AA和MDS与难治性ITP,从而进一步提高ITP诊断的精确性。（2）CH-ITP患者中最常见的突变基因为DNMT3A、TET2和ASXL1,最常见的突变类型是转换,这在各种疾病中具有共性。（3）ITP患者CH的发生与年龄增长有关,与性别、病程、有无抗血小板自身抗体均无关。CH阳性的ITP患者较阴性患者相比血小板有降低趋势,发生严重出血的概率更大,因此靶向测序有助于判断患者的疾病严重程度。（4）存在CH的ITP患者对激素的初始反应较无CH的患者更差,最终进展为难治性ITP的可能性更高,因此靶向测序有助于预测患者的疗效,判断预后。