背景和目的梗阻性肾病(Obstructive nephropathy,ON)是由于某些原因引起尿路梗阻,导致尿液排出受阻,压力逆向传导,导致肾盂和肾小管内压力增高,引起的肾实质损害和肾功能障碍。ON是急性或慢性肾衰竭的常见原因,也是反复发作的难治性尿路感染的常见诱因。在儿童,ON是终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的常见诱因,占需要肾移植儿童的16%和慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)发病率的21%。文献报道,在英国ON是导致儿童CKD的第三大原因,占15%。在美国,需要进行肾替代治疗的患者中,有1.4%的是ON患者。引起ON的原因随着年龄不同而有所不同。解剖学异常导致的梗阻通常见于儿童,而成人多为获得性原因。肾盂输尿管连接部梗阻(Pelvic-ureteral junction obstruction,PUJO)是引起肾积水的最常见解剖学原因,也是产前超声检查最常见的畸形,发生率为1%-2%。其他引起儿童尿路梗阻的原因包括输尿管膀胱连接部梗阻、后尿道瓣膜、尿道闭锁或狭窄以及神经源性膀胱等。前列腺性梗阻、肿瘤、肾结石、输尿管狭窄和腹膜后纤维化等是引起成人尿路梗阻的主要原因。PUJO是儿童先天性肾积水(Congenital hydronephrosis,CHN)的主要病因,且梗阻多为不完全性。事实上,先天性ON是引起婴幼儿和儿童肾衰竭的常见原因,但接近50%的患儿输尿管扩张并未发现有机械性梗阻,且肾盂和输尿管壁也没有结构性异常,通常认为这种情况是由尿液流出道(肾盂、输尿管或膀胱)蠕动功能受损引起,但是导致输尿管蠕动功能受损的潜在机制仍不清楚。目前对CHN的病理生理仍缺乏了解,以至于对先天性PUJO造成的新生儿肾积水手术时机仍有争议。由于CHN发生于胚胎时期,限制了相关动物模型的建立和进一步研究。大鼠出生时,肾脏并未发育成熟,与人类胚胎晚期肾脏成熟度类似。因此,常用新生大鼠建立输尿管梗阻(Ureter obstruction,UO)模型来模拟人类的CHN,试图了解更多关于CHN病理生理变化情况,但是相关研究多着重于输尿管梗阻后后肾脏相关蛋白分子表达变化的情况。虽然有文献报道在新生大鼠采用腰大肌埋植法建立单侧输尿管部分梗阻(Partial unilateral ureter obstruction,PUUO)模型,但是新生鼠PUUO后对肾盂压力、蠕动节律以及蠕动波振幅等参数的影响尚未见报道。众所周知,ON早期的主要病理生理改变为肾盂和肾盏扩大及肾脏集合管扩张,随着扩张程度增加,集合系统和肾实质受压引起尿浓缩功能受损。文献报道输尿管梗阻导致肾脏水通道蛋白2(Aquaporin 2,AQP2)表达下调与尿液浓缩功能下降有关。AQP2是水通道蛋白家族成员之一,主要分布于集合管主细胞管腔膜和靠近顶质膜的囊泡内,控制水在集合管细胞的重吸收过程。有研究显示即使早期手术解除梗阻,但肾脏浓缩功能仍不能完全恢复,这与解除梗阻后肾脏AQP2未能马上恢复正常有关。虽然很多学者着眼于梗阻阶段及解除梗阻后肾脏浓缩功能的保护研究,但目前仍未找到适合预防婴幼儿梗阻性肾病AQP2下调的方法。生理状态下抗利尿激素(Antidiuretichormone,ADH)可以调控AQP2的表达与分布,但其对于梗阻解除后的多尿无明显效果,可能与肾脏ADH的V2受体下调、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)合成增多而对抗ADH的作用以及ADH的效应蛋白AQP2表达下调有关。沙坦类药物(血管紧张素受体拮抗剂)能够防止梗阻造成的AQP2下调,但婴幼儿应用此类药物可能加重梗阻造成的肾脏损伤,限制了其临床应用。近年,促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)保护梗阻性肾脏功能的报道引起了大家的重视。Nakazawa等人研究发现,EPO通过抗凋亡等非造血功能发挥肾脏保护作用。Kitamura等发现使用EPO及其衍生物(氨甲酰化EPO)能防止凋亡,减轻输尿管梗阻肾间质纤维化,减少平滑肌肌动蛋白表达。Souza等在急性肾衰竭动物模型中发现EPO可抑制NF-κB,减轻炎症反应并能拮抗其抑制AQP2表达的作用,避免AQP2下调。Gong等也观察到EPO能预防缺血再灌注肾脏AQP2蛋白及m RNA的下调。但是EPO是否可以预防PUUO导致的肾脏AQP2表达下调,是否可以促进双侧输尿管梗阻-解除梗阻后(Bilateral ureter obstruction-released,BUO-R)肾脏AQP2的表达恢复、以及促进BUO-R肾脏功能、水盐处理功能恢复等均未见文献报道。目前,临床上已经应用EPO治疗小儿缺血缺氧性脑病,但EPO能否用于CHN肾脏功能的保护有待进一步研究。大鼠各种UO模型已经用于梗阻造成的AQP2下调、炎症介质产生、肾小管细胞凋亡和肾间质纤维化等方面的研究。PUUO模型更接近临床上由输尿管部分梗阻引起的CHN患儿的病理生理变化,但是输尿管部分梗阻的程度不容易控制和量化。而输尿管完全梗阻模型,梗阻程度易于控制和量化,常用于验证梗阻引起的肾脏的病理生理机制,但是临床完全梗阻的CHN患儿少见。本研究拟分别采用输尿管部分梗阻和全部梗阻模型,验证新生鼠输尿管部分梗阻的程度和输尿管完全梗阻造成肾脏病理生理改变的机制。因此,本研究的主要目的包括:(1)建立新生鼠PUUO模型,并进行上尿路穿刺测压,检验腰大肌埋植法建立新生鼠PUUO模型的效果,探讨输尿管部分梗阻对肾盂压力、蠕动节律的影响,并对PUUO程度进行量化;(2)建立幼鼠PUUO模型,并给予EPO干预,探讨EPO对PUUO幼鼠肾脏AQP2表达的影响;(3)建立幼鼠BUO-R模型,并给予EPO干预,探讨EPO对BUO-R幼鼠肾脏AQP2表达的影响;(4)建立幼鼠BUO-R模型,并给予EPO干预,探讨EPO对BUO-R幼鼠肾脏功能、水盐处理功能的影响并对其机制进行初步探索。本研究主要通过建立PUUO新生鼠模型,并验证腰大肌埋植法建立PUUO模型的质量控制,探讨输尿管梗阻后对肾盂压力和蠕动功能的影响以及如何促进输尿管梗阻后肾脏功能和功能性蛋白表达的恢复进行研究,以期对CHN发生发展机制以及治疗两个方面发挥一定作用。第一部分:新生鼠PUUO模型的建立及肾盂压力和蠕动节律的观察研究材料和方法1.出生2d后的新生SD大鼠30只,体重(8.07±0.39)g,随机分为PUUO组、CUUO组和Sham组,各组n=10。将新生鼠麻醉后,打开腹腔暴露左侧输尿管,PUUO组将左侧输尿管于肾静脉水平以下0.3cm处埋植于腰大肌内;CUUO组将左侧输尿管同样于肾静脉水平以下0.3cm处结扎;Sham组只钝性分离左侧输尿管,不进行埋植或结扎。2.术后1周,称取幼鼠体重,再次麻醉后打开腹腔,暴露左侧肾脏。采用静脉留置针与尿动力学测压管相连,并连接尿动力仪,采用恒速微量泵精确控制灌注速度,起始灌注速度设置为5ml/h,边穿刺边测压。待穿刺针进入肾盂并压力稳定后,记录3min,然后调整灌注速度,分别至10ml/h、20ml/h、30ml/h、40 ml/h、50 ml/h、60 ml/h和80ml/h,每个灌注速度均记录3min。测压结束后,颈椎脱臼法处死幼鼠,取出左侧肾脏,测量肾脏各径线和重量。记录并比较各组幼鼠每个灌注速度时肾盂压力、蠕动波频率、波幅等参数。3.统计学处理:采用SPSS10.0统计学软件进行数据处理分析,计量资料数据采用x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。计数资料采用率表示,组间比较采用χ2检验。以α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.肾脏外观和径线比较:肉眼观CUUO组左肾脏最大,呈粉红色、颜色较淡,可见肾盂积水严重、并突出于肾门外;PUUO组左肾脏稍大,呈灰红色、颜色稍淡,未见肾盂积水及突出肾门的情况;Sham组左肾最小,呈红褐色、颜色较重,未见肾盂积水及突出肾门的情况。经过测量,CUUO组肾脏各径线均最大,PUUO组次之,而Sham组最小(左右径:0.81±0.06cm vs.0.66±0.08cm vs.0.52±0.09cm;前后径:0.78±0.08cm vs.0.62±0.06cm vs.0.49±0.07cm;上下径:1.23±0.08cm vs.1.08±0.08cm vs.0.96±0.07cm);三组左侧肾脏经称量后发现PUUO组肾脏最重,而CUUO组肾脏重量最轻,Sham组居中(0.14±0.01g vs.0.10±0.02g vs.0.12±0.02g),差异均有统计学意义。2.肾盂测压各参数比较:Sham组肾盂压力随着灌注速度的增加而逐渐增加,但趋势较缓慢;蠕动波频率随着灌注速度的增加快速升高,在20ml/h的灌注速度时最高,达0.0875,而后随着灌注速度的增加而降低。蠕动波的振幅与频率类似,在30ml/h的灌注速度时达到最高36cm H2O,而后随着灌注速度增加而降低。当灌注速度达20ml/h时,肾盂蠕动波主波后开始出现副波,且振幅随灌注速度增加而降低;副波波峰与主波波峰之间的间距较为恒定(均为4s)。PUUO组肾盂压力也随着灌注速度增加而增加,但均高于Sham组,且上升趋势较快。蠕动波频率较Sham组高,且40ml/h之前的蠕动频率较为接近,但灌注速度再增加时,蠕动波频率开始下降。蠕动波振幅随着灌注速度增加出现快速增加后开始下降,且下降速度较Sham组快。当灌注速度达20ml/h时,肾盂蠕动波主波后也开始出现副波,振幅随灌注速度增加而降低,且均低于Sham组。副波波峰与主波波峰之间的间距变化较大(3.9s-6.1s,平均为5.1s)。CUUO组肾盂基础压力为12cm H2O,但在5ml/h的灌注速度下,随着灌注时间延长,肾盂压力逐渐升高,未出现平台期,直至肾盂压力达到73cm H2O时,灌注液自穿刺针旁逆行流出,肾盂压力稍下降后达到平衡,整个过程未见规律肾盂蠕动波出现。第二部分:EPO对PUUO幼鼠肾脏AQP2表达影响的实验研究材料和方法1.6-7周龄幼年雄性SD大鼠24只,体重(160±8)g,随机均分为PUUO组、PUUO+EPO组和Sham组,各组n=8。幼鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后,打开腹腔暴露并分离左侧输尿管,并钝性分离输尿管下方腰大肌为一纵沟,将输尿管包埋入纵沟建立PUUO模型。PUUO+EPO组分别于术后1h、1d、3d、5d给予EPO腹腔注射;PUUO组同时腹腔注射等剂量的生理盐水。Sham组幼鼠只分离左侧输尿管,但不包埋。2.术后一周对各组幼鼠进行肾脏MRI检查,以进一步确定PUUO建模效果,然后颈椎脱臼法处死大鼠,收集左侧肾脏标本,采用免疫组化、Real-time PCR和免疫印迹(Western-blot)检测并比较三组幼鼠肾脏AQP2蛋白和m RNA的表达情况。3.统计学处理:采用SPSS10.0统计学软件进行数据分析处理,计量资料数据采用x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。计数资料采用率表示,组间比较采用χ2检验。以α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.MRI检查结果显示左侧肾脏因手术瘢痕牵拉而位置稍微下移。大鼠为单盏肾,左侧肾脏肾盂部位较右肾明亮,有轻度积水。2.免疫组化结果显示AQP2阳性细胞呈棕黄色,主要集中在内髓集合管,位于主细胞顶端膜和胞质中。Sham组染色强度最明显,PUUO+EPO组次之,PUUO组最弱,但仍有微弱表达。组织学上可见PUUO+EPO组和PUUO组集合管管壁变薄、管腔增大,明显不同于Sham组。3.Real-time PCR结果显示Sham组幼鼠肾脏组织中AQP2 m RNA表达最多,PUUO+EPO组次之,PUUO组表达最少,三组ΔCt值分别为:-7.6±0.18 vs.-9.7±0.54 vs.-10.8±0.31,差异有统计学意义(P<0.05)。经公式2-ΔΔCt计算组间AQP2m RNA表达量的相对倍数,结果显示Sham组是PUUO+EPO组的2.1倍、是PUUO组的9.2倍,PUUO+EPO组是PUUO组的4.3倍。4.Western-blot结果显示,Sham组AQP2蛋白表达量最高,PUUO+EPO组次之,而PUUO组表达量最低,分别为:0.29±0.016、0.64±0.106和0.84±0.134,差异有统计学意义,(P<0.05)。第三部分:EPO对BUO-R幼鼠肾脏AQP2表达影响的实验研究材料和方法1.6-7周龄雄性SD幼鼠32只,体重(163±6)g,随机均分为BUO组、BUO-R组、BUO-R+EPO组和Sham组,各组n=8。实验组大鼠均行双侧输尿管完全结扎,BUO组梗阻24h后颈椎脱臼法处死;BUO-R组和BUO-R+EPO组梗阻24h后解除梗阻,BUO-R+EPO组分别于解除梗阻后2h、6h、12h、24h和36h腹腔注射EPO,48h后处死;BUO-R组在相同时间点腹腔注射等量生理盐水,48h后处死;Sham组只分离输尿管,不结扎,72h后处死。2.留取双侧肾脏标本,采用Real-time PCR、免疫组织化学及Western blot检测并比较各组肾脏组织中AQP2 m RNA及蛋白表达水平。3.统计学处理:采用SPSS10.0统计学软件进行数据分析处理,计量资料数据采用x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。计数资料采用率表示,组间比较采用χ2检验。以α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.免疫组织化学结果显示AQP2阳性细胞呈棕黄色,主要集中在内髓集合管,位于主细胞顶端膜和胞质中。Sham组染色强度最明显,BUO-R组和BUO-R+EPO组次之,BUO组最弱,但仍有微弱表达。组织学上可见BUO组、BUO-R组和BUO-R+EPO组集合管管壁变薄、管腔增大,明显不同于Sham组。2.Real-time PCR结果显示,Sham组ΔCt值最小,AQP2 m RNA表达最高,BUO-R+EPO组次之,BUO-R再次,BUO组ΔCt值最大,AQP2 m RNA表达最低,四组ΔCt值分别为-3.7±0.18 vs.-1.2±0.17 vs.-0.3±0.11 vs.0.9±0.23,差异有统计学意义,(P<0.05)。经公式2-ΔΔCt计算组间AQP2 m RNA表达量的相对倍数,结果显示Sham组是BUO组的24.3倍,是BUO-R组的10.6倍、是BUO-R+EPO组的5.7倍,BUO-R+EPO组是BUO-R组的1.9倍。3.Western blot结果显示,Sham组AQP2蛋白表达量最高,BUO-R+EPO组次之,BUO-R组再次,而BUO组表达量最低,分别为0.97±0.022、0.68±0.025、0.54±0.022和0.43±0.118,差异有统计学意义,(P<0.05)。第四部分:EPO对BUO-R幼鼠肾脏功能保护作用及其机制的实验研究材料和方法1.6-7周龄幼年雄性SD大鼠32只,体重(165±7)g,随机均分为BUO组、BUO-R组、BUO-R+EPO组和Sham组,n=8。实验组大鼠均行双侧输尿管完全结扎,BUO组梗阻24h后颈椎脱臼法处死;BUO-R组和BUO-R+EPO组梗阻24h后解除梗阻,BUO-R+EPO组分别于解除梗阻后立即、2d、4d和6d腹腔注射EPO,BUO-R组在相同时间点腹腔注射等量生理盐水,7d后处死。Sham组只分离输尿管,不结扎,与实验组同时处死。2.幼鼠处死前24h放入代谢笼内收集尿液进行渗透压和电解质检测。处死后快速打开腹腔,经下腔静脉抽取1ml血液标本进行肾功能及电解质检测。收集双侧肾脏标本,采用免疫组织化学及Real-time PCR检测TNF-α和IL-6表达及m RNA水平。记录并比较各组各相关参数。3.统计学处理:采用SPSS10.0统计学软件进行数据分析处理,计量资料数据采用x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。计数资料采用率表示,组间比较采用χ2检验。以α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.尿量和尿液渗透压及电解质测定结果显示,Sham组尿液渗透压最高(1835±98 mosm/kg),BUO-R+EPO组为(1164±93 mosm/kg),BUO-R组最低(715±76 mosm/kg),三组之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Sham组尿量最少(24±3μl/min kg),BUO-R+EPO组次之(41±5μl/min kg),BUO-R组最多(66±7μl/min kg),三组之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。BUO-R+EPO组尿液中K+、Na+、和肌酐浓度为(132.5±4.95 mmol/L、131.3±3.06 mmol/L和3875±343μmol/L),分别低于Sham组(152.3±5.21 mmol/L、168.5±3.54 mmol/L和4698±744μmol/L),但是高于BUO-R组(105.1±6.32 mmol/L、98.3±3.25 mmol/L和2509±556μmol/L),差异有统计学意义(P<0.05)。2.血液电解质及肾功能检测结果显示,BUO组血K+浓度为(11.5±0.71mmol/L),分别高于Sham组(6.9±0.16 mmol/L)、BUO-R组(7.9±0.66 mmol/L)和BUO-R+EPO组(7.5±0.31 mmol/L),差异有统计学意义;血Na+浓度为(123.1±6.03 mmol/L),分别低于Sham组(137.8±5.37 mmol/L)、BUO-R组(146.7±4.53 mmol/L)和BUO-R+EPO组(142.9±6.51 mmol/L),差异有统计学意义。BUO组血尿素氮和肌酐浓度(58.4±4.63 mmol/L和277.3±5.06μmol/L)均高于其它三组,而BUO-R+EPO组(6.2±1.34 mmol/L和25.7±0.58μmol/L)虽然高于Sham组(5.4±0.15 mmol/L和20.5±0.71μmol/L),但低于BUO-R组(7.7±0.27 mmol/L和32.6±0.83μmol/L),差异均有统计学意义(P<0.05)。3.免疫组织化学结果显示TNF-α主要分布于肾小管和集合管等肾实质部分,肾小球也可见到少量表达,且肾皮质表达强于肾髓质。BUO组TNF-α阳性染色最强,BUO-R组强于BUO-R+EPO组,Sham组表达最弱;IL-6也主要分布于肾小管和集合管等肾实质,肾小球内以及壁层肾小球囊可见阳性表达,同样肾皮质表达强于肾髓质,BUO组IL-6阳性染色最强,BUO-R组强于BUO-R+EPO组,Sham组表达最弱。4.Real-time PCR检测,BUO组TNF-α表达最多,BUO-R组次之,BUO-R+EPO组再次,Sham组表达最少,四组TNF-αΔCt值分别为:1.8±0.12vs.3.1±0.15 vs.4.4±0.18 vs.5.3±0.22,P<0.05。经2-ΔΔCt公式计算,BUO组是BUO-R组的2.5倍,是BUO-R+EPO组的6.1倍,是Sham组的11.3倍;IL-6在BUO组表达最多,BUO-R组多于BUO-R+EPO组,Sham组最少,四组IL-6ΔCt值分别为:-1.8±0.14 vs.0.5±0.11 vs.1.1±0.13 vs.1.9±0.12,P<0.05。经2-ΔΔCt公式计算,BUO组是BUO-R组的4.9倍,是BUO-R+EPO组的7.5倍,是Sham组的13.0倍。结论1.采用腰大肌埋植法可成功建立PUUO新生鼠模型,且质量控制较好,输尿管梗阻程度较为均一;2.PUUO对肾盂蠕动功能有显著影响,其对蠕动频率、幅度及肾盂压力等产生的影响有一定规律可循,为探索PUUO后肾盂蠕动功能改变提供了线索;3.EPO可部分阻止PUUO幼鼠肾脏AQP2 m RNA及蛋白表达下调;4.EPO可促进BUO-R幼鼠肾脏AQP2 m RNA及蛋白表达恢复;5.EPO可通过抑制炎症反应促进BUO-R幼鼠肾脏功能及水盐处理功能的恢复,发挥肾脏保护作用。