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本研究在大鼠双肾缺血再灌注致慢性肾病模型上,运用免疫学、蛋白组学等实验方法试图找到与慢性肾病相关的自身免疫靶抗原。首先(1)利用大鼠慢性肾病模型,在大鼠双侧肾动脉夹闭75min后导致肾脏缺血再灌注损伤。40周后监测发现疾病组出现肾功能损害,第48、52周时蛋白尿(尿蛋白/尿肌酐,g/mmol)水平达(0.94±0.15)、(1.67±0.50),与正常对照组(<0.30)相比有显著差异;免疫荧光检测疾病组肾脏有IgG抗体沉积,HE染色显示疾病组肾发生纤维化改变,提示慢性肾病动物模型建立。(2)提取正常大鼠肾脏总蛋白,以模型大鼠血清为一抗做Elisa和Westen Blot实验,验证大鼠肾脏总蛋白与疾病大鼠血清存在抗原抗体反应。Elisa实验显示疾病大鼠血清与正常大鼠肾脏总蛋白有抗原抗体反应,疾病组(平均OD值为0.5011±0.047)与对照组(平均OD值为0.2370±0.019)相比有显著性差异;疾病组血清为一抗与大鼠肾脏蛋白的Westen Blot实验有免疫印迹条带出现。然后(3)分别提取疾病组和对照组大鼠肾脏总蛋白做免疫共沉淀实验(COIP),用A/G琼脂糖磁珠-兔抗大鼠IgG来捕获肾脏中的抗原抗体复合物,经沉淀、纯化、洗脱、电泳,初步确定只在疾病组显现的37KDa条带为的目标蛋白条带。(4)切取经(3)共沉淀的凝胶电泳分离的目标蛋白做质谱检测分析,筛选出前10个可能性靶蛋白(按照氨基酸序列匹配度排名)。(5)对氨基酸序列匹配度排名前2位的丙种球蛋白IgG2a(氨基酸序列匹配率达到96.3%)和原肌球蛋白3(tropomyosin alpha-3 chain,TPM3)(氨基酸序列匹配率达到76.4%),用抗IgG2a和抗TPM3的商品化已知抗体与正常大鼠总蛋白做一维凝胶Westen Blot实验,确定符合分子量37KDa的目标蛋白为TMP3,而与IgG2a反应的条带为25KDa和50KDa。最后(6)用正常大鼠总蛋白做二维凝胶电泳,分别用已知TMP3抗体、慢性肾病大鼠血清、对照组大鼠血清为一抗做Westen Blot实验,进一步鉴定TMP3为慢性肾病相关的自身免疫靶蛋白;并且疾病肾脏中TMP3的表达水平高于正常肾脏。(7)以Elisa实验检测慢性肾病大鼠血清中抗TMP3及抗Vimentin(Vim)抗体水平,比较二种蛋白在慢性肾病中的免疫原性强弱。实验显示疾病组大鼠抗TMP3和抗Vim抗体都呈阳性反应,但疾病组TMP3抗体水平高于对照组(P(27)0.05),而疾病组Vim抗体水平与对照组无显著性差异(P>0.05)。本研究在大鼠双肾缺血再灌注致慢性肾病模型上,首次筛选到与慢性肾病相关的自身免疫靶蛋白TMP3,其具有较强的免疫原性和慢性肾病相关性。研究结果对于慢性肾病的诊断和治疗具有积极意义。