小麦遗传转化研究及小麦叶基部胚性愈伤诱导与植株再生

来源 :中国科学院研究生院(上海生命科学研究院) | 被引量 : 0次 | 上传用户:WHO891225
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利用2个农杆菌菌株与质粒组合(EHA105/pC3301和AGL-1/pDM805)对3个普通小麦(Triticum aestivum L.)品种(扬麦158、扬麦10和G8901)进行了遗传转化,探讨了影响转化的几个重要因素。研究结果表明,筛选过程中培养基中添加250 mg/L头孢霉素和100 mg/L羧苄青霉素能有效抑制农杆菌的生长且不影响愈伤组织的生长和分化。菌液浓度、浸染时间、共培养温度和共培养时间综合影响转化结果,较低的共培养温度(23~24℃)和较短的共培养时间(3~4 d)有利于抗性愈伤的分化。预培养1~4 d的幼胚处于转化的最佳时期,AS的添加有利于T-DNA的转移,共培养结束后用含抗生素的液体培养基洗涤效果最好。对3种筛选方式进行比较,发现缩短愈伤筛选时间,延长中等筛选剂浓度的分化筛选时间有利于转化植株的存活,结合后期的叶片涂抹筛选可有效筛选出转化植株。本研究从不同菌株转化不同小麦品种的多次转化实验中共得到移栽成活的抗性株16个,但叶片涂抹筛选仅从EHA105/pC3301转化扬麦158得到的抗性株中检测到2个阳性植株,PCR和Southern blot分析证明外源DNA确实已整合到这2个阳性植株的基因组中。冬性小麦品种G8901对农杆菌侵染十分敏感,感染后受损严重。因此,我们用基因枪法将pC3301质粒转入预培养3~5 d的G8901幼胚,经3周抗性愈伤筛选、2周分化筛选、2周延长筛选和2周生根筛选,最终得到2个抗性植株。PCR和PCR-Southern blot分析初步证明外源基因已整合到2个植株中。但2个转化植株虽然能够移栽成活,但出现表型异常和不育现象。由于小麦幼胚材料的供应受季节和时间限制很大,我们进行了从小麦叶基部诱导体细胞胚发生和植株再生的尝试,并初步建立了再生体系。从3-4 d龄的小<WP=42>麦叶片各切块均能诱导形成致密胚性愈伤组织,但仅能从叶片基部1~1.5 mm的切块形成的愈伤组织再生出完整植株。胚性愈伤诱导率和植株再生率与培养基的种类、培养基中2,4-D的浓度、小麦基因型及诱导和分化培养基中激素种类和浓度等有关。含4.5~9.0 μmol/L 2,4-D的MS培养基比N6和L3培养基更适合小麦叶基部胚性愈伤的生长和分化。愈伤诱导培养基中添加一定浓度的BAP不能提高胚性愈伤率和再生频率,但能够加速芽苗的出现。将愈伤诱导培养基中2,4-D、BAP和NAA的浓度调整到合适比例只能得到与对照相似的再生频率。分化培养基中添加细胞分裂素(BAP或KT)不能提高再生频率。再生植株转移到土壤中后都能生长成表型正常的可育植株。
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