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目的：探讨研究成骨生长肽(OGP)对兔骨髓间充质干细胞体外培养增殖及成骨分化的影响并探讨骨髓间充质干细胞在OGP浓度10-11-10-7mol/L范围内的细胞最适宜增殖浓度以及最适宜成骨分化浓度,为成骨生长肽(OGP)进一步实验室研究及体内研究提供可靠的理论依据方法：取达到清洁级标准,无人畜共患疾病的新西兰大白兔一只,不限雌雄,使用兔耳缘静脉空气栓塞发处死。严格遵守无菌原则取出双侧股骨干。使用DMEM/F12培养液冲洗髓腔,获得细胞悬浊液。应用全骨髓培养法分离出骨髓单核细胞,使用贴壁法可以除去没有贴壁的悬浮细胞。经过反复多次的传代培养能够获得较为纯净的贴壁细胞,使用免疫组化检测贴壁细胞的表面标记物CD44,可以证实所得的细胞为骨髓间充质干细胞。贴壁法分离获得的兔骨髓间充质干细胞,通过换液和传代纯化细胞。用传二代细胞做MTT试验,以此确定OGP对骨髓间充质干细胞增殖作用的最佳活性浓度；将传二代骨髓间充质干细胞,以2×104/m1的密度接种于96孔培养板中,每孔加入200u1细胞悬浊液。一共接种7板,每组接种6孔,每板接种36孔。分为对照组与实验组,具体如下：分为六组：A组-对照组,B组加入10-11mol/L的OGP,C组加入10-10mol/L的OGP,D组加入10-9mol/L的OGP,E组加入10-8mol/L的OGP,F组10-7mol/L的OGP。对照组为不含血清的DMEM/F12培养基。将传3代骨髓间充质干细胞接种于16孔板中,每组接种4孔,共获取16个样品。分别于第五天,十天,十五天,二十天四个时间点收集。每一时间点设置6个复孔分别检测碱性磷酸酶的活性,以确定促进骨髓间充质干细胞成骨分化最佳OGP活性浓度。分组具体如下：A组培养液为50μg/ml维生素C+10mmol/L β-甘油磷酸钠+10-7mol/LOGP；B组培养液为50μg/ml维生C+10mmol/L β-甘油磷酸钠+10-9mol/LOGP；C组培养液50μ g/ml维生素C+10mmol/L β-甘油磷酸钠+10-11mol/LOGP;D组(对照组)培养50μg/ml维生素C+10mmol/Lβ甘油磷酸钠。在最适宜骨髓间充质干细胞成骨分化的OGP浓度培养下的骨髓间充质干细胞的细胞形态学观察,以及对其进行碱性磷酸酶(ALP)Gomori钙钴染色,Von kossa改良染色,和MTB比色法进行钙定量检测。分为两组：A组对照组单纯培养液组；B组加入OGP的培养液组。结果骨髓间充质干细胞分离培养后最初培养器中造血细胞成份较多,随着时间的延长,这些杂质细胞慢慢坏死或随换液移去,2日后能够见到部分细胞开始贴壁生长,大约4日后可见大量细胞贴壁,成集落,细胞开始呈长梭形,形似成纤维细胞,呈放射状生长。培养至12天左右,细胞融合超过90%予以传代,培养到第3代后,骨髓间充质干细胞就较纯粹,极少杂质细胞。对培养细胞用免疫组化进行分析,发现骨髓间充质干细胞的特异性抗体CD44(+)。证明培养的细胞为骨髓间充质干细胞。将成骨诱导培养液加入至骨髓间充质干细胞的培养后,细胞生长表现为会有一个较长的生长平台期约一天至两天,此时细胞呈缓慢生长,于此同时细胞形态也大多发生改变,我们观察到细胞慢慢由纺锤形渐渐转变为立方形,然后变更为多边形,细胞体积变大,胞浆边浓密；对细胞进行消化传代培养,传代到P3代时,细胞会经过一长约24到48小时左右的潜伏期,在将近第150到200小时左右时,细胞度过平台期,开始呈对数生长,后仍会过渡到平台期。MTT染色法测定OGP的最大活性浓度：骨髓间充质干细胞在含有OGP的培养基中生长,光吸收度数值均比其对照组(无OGP的培养基)中的光吸收度数值要高。当培养基中的OGP浓度为10-11mol/L时,可以获得最积极的细胞生长增殖。碱性磷酸酶测定骨髓间充质干细胞活化的最适宜OGP的浓度：D组(对照组)中碱性磷酸酶的表达一直处于较低水平的表达。与其他组相比,其余组的ALP表达显著升高。而A,B,C组中又以B组(OGP浓度为10-9mol/L)的碱性磷酸酶活性表达最高。对于内含10-9mol/L的GOP的培养液对骨髓间充值干细胞成骨诱导的形态学观察,碱性磷酸酶(ALP) Gomori钙钴染色法,Von Kossa改良然染色法,以及MTB比色法进行钙定量检测：第一应用10-9mol/L的OGP的培养液后细胞渐渐由纺锤形转变为立方形,在变为多边形,细胞表面积变大,细胞核、质分界清楚,细胞浆浓密,细胞呈阶层是增长,未见接触抑制,形成广泛分布的细胞结节。第二碱性磷酸酶(ALP)Gomori钙钴染色法,于诱导后第14天至21天时发现：碱性磷酸酶在由大多数弱阳性或阴性,少数强阳性逐渐转变成几乎全部的细胞均呈现出强阳性。并且细胞质中随处可见黑色颗粒或块状沉淀。而对照组无阳性表现出现。第三Von Kossa改良然染色法测定钙的沉积,同样于诱导后第14天至21天时发现：逐渐增多,颜色加重的结节。由棕黑色逐渐变为黑色,并且越来越多,越变越大。而对照组无此变化。第四MTB比色法进行钙定量检测,在第5天,10天,15天,20天分别使用MTB比色法测定,在含有OGP (10-9mol/L)培养基培养下的骨髓间充质干细胞成骨诱导明显高于对照组(无OGP)。方差统计分析算得p<0.05,具有统计学意义。结论1.进一步证实了OGP对兔骨髓间充质干细胞的增殖活性有明显的促进作用,并且最佳作用浓度为10-11mol/L,在(10-7-10-11mol/L)浓度范围内存在负相关量效关系2.OGP促进骨髓间充质干细胞的ALP表达的最佳浓度为10-9mol/L.并且所有添加了OGP的培养基培养的骨髓间充质干细胞的成骨诱导均优于普通矿物培养基培养的骨髓间充质干细胞。