论文部分内容阅读
本文研究了顺式环氧琥珀酸水解酶(ESH)的发酵、纯化及生化特性，构建了表达可溶性重组ESH的E.coli工程菌，开发了基于该工程菌的L-(+)-酒石酸的酶促生产工艺。
研究了野生菌(N.tartaricans)发酵生产ESH的过程，从中发现葡萄糖对ESH的诱导表达具有一定的阻遏作用。采用补料分批发酵策略控制基质浓度可以提高ESH的发酵单位，并放大到100L发酵罐，发酵周期约44h，菌体浓度达48.4g/L，ESH比酶活达208.45U/g，比批次发酵提高了38.9％。
对ESH进行了分离纯化，粗酶液经硫酸铵分级沉淀以及DEAE Sepharose Fast Flow等层析获得电泳纯的ESH，比酶活为9.24×102U/mg，收率为18.8％。Edman测序显示，N-木端氨基酸序列为MQLNNANDNTQF。研究发现，ESH是一个单亚基蛋白质，相对分子质量为28，139Da，其最适反应温度和pH分别为37℃和8.0。Fe3+、Fe2+、Cu2+、Ag+及表面活性剂显著抑制ESH的活性。此外，ESH的催化活性不依赖于二价金属离子，但其活性中心可能存在某种金属离子并在酶构象稳定方面起到一定的积极作用。
构建了温度诱导表达的、具有噬菌体抗性的E.coliTrans(1)-T(1)/pBV220-ESH工程菌，优化了其培养条件。2000L发酵结果显示，该工程菌的菌体浓度可达62.45g/L，重组ESH比酶活为380.17U/mg，发酵单位为1.25×106U/(h·L)，是野生菌ESH发酵单位的150倍，高于已报道的该酶的发酵水平，而且单位酶活的生产成本降低了85％。
研究了E.coli工程菌细胞催化生产L-(+)-酒石酸的过程工艺。ESH酶用量为240U/100mL时，E.coli工程菌细胞的催化效率为8.99×10-3g/(U·h)，L-(+)-酒石酸产率为21.59g/(L·h)。设计了Na-Ca双底物非均相L-(+)-洒石酸酶促转化工艺并完成了中试，在30m3反应釜中，重组ESH的催化效率为7.92±1.34×10-3g/(U·h)，L-(+)-酒石酸的产率提高了近60％，该工艺已在企业生产中获得应用。
研究了通过组氨酸标签固定化ESH的催化过程。采用金属螯合层析介质直接吸附带his-tag的ESH，固定化ESH的酶活收率为94.59％。最佳催化条件下，ESH的催化效率为1.04×10-2g/(U·h)，L-(+)-酒石酸的产率为1.08×103g/(L·h)，高于E.coli细胞的催化效率。