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腺病毒载体是目前国际转基因治疗人类疾病中应用得最广泛的载体,有宿主范围广、对人致病性低、安全可靠等优点,在治疗癌症、遗传病等方面取得了可喜的进展,有良好的发展势头。腺病毒载体可以感染各种分裂和不分裂的哺乳动物细胞,腺病毒载体并不插入宿主染色体,所以避免了造成宿主基因突变,安全性有所保障;但是这也决定了腺病毒只能在宿主细胞内瞬时表达。腺病毒用于基因治疗,转染宿主细胞的效率是关键。提高腺病毒的转染效率,就可以使用更少的腺病毒达到治疗目地,也就提高了经济效益和安全性。如何用更少的腺病毒获得需要的表达水平,是学者们孜孜不倦地追求的目标。钙离子螯合剂EGTA被证实能大幅提高腺病毒的转染效率,但是EGTA难溶于中性水,需要用强碱溶液（比如氢氧化钠）溶解,而强碱溶液对于机体有很大的副作用,从而限制了EGTA在医学上的应用。BAPTA是日本同仁化学研究所推出的一种新型钙离子螯合剂,螯合钙离子的能力比EGTA要强许多,而且不需要强碱溶解,可以直接在生理酸碱度下发挥作用。BAPTA目前尚未用于提高腺病毒转染效率,本研究将BAPTA用于提高腺病毒转染效率,并与EGTA做对照,以此验证BAPTA代替EGTA用于提高腺病毒转染率的可行性。哺乳动物乳腺生物反应器是时下生物技术领域的研究热点。哺乳动物乳房是一种天然、高效的合成蛋白质的器官,而且本身具有良好的渗透屏障,能有效地限制外源基因表达的产物进入体液循环。可以通过技术手段把哺乳动物乳腺改造成生物反应器,以期源源不断地生产出目标药物蛋白。目标基因在动物乳腺上皮细胞中表达,并分泌到乳汁中,从而在动物乳汁中获得重组蛋白药物。其优势在于:（1）不需要构建乳腺特异表达载体,程序简单,并且不需要昂贵、精密仪器;（2）试验样本不需要经过残酷的淘汰筛选,成功率高;（3）腺病毒载体不干扰动物乳腺染色体稳定体系,经过短期高效表达,腺病毒自动失活,不会影响子代动物的遗传特征;（4）目标药物蛋白在乳腺中表达,条件容易掌握,表达水平稳定。本研究以人促红细胞生成素重组腺病毒为载体,进行了乳腺表达生产人促红细胞生成素的试验研究,以期探索出高效、简便的蛋白药物生产方法,从而为蛋白药物生产提供新的途径。本研究分为如下五个部分:1.克隆人促红细胞生成素序列,并构建真核表达载体。从流产胎儿的肝脏组织提取人总RNA,利用RT-PCR技术,获得人促红细胞生成素的全长cDNA序列,经DNA测序分析,所得cDNA序列与GeneBank序列（ACCESSION NM000799）一致。以pcDNA3.1、pIRES为基础质粒,构建了含有人促红细胞生成素基因的重组真核表达载体p3IG和p3EIG。2.人促红细胞生成素的细胞表达试验。将上述构建的人促红细胞生成素真核表达载体分别在CHO、和HEK293细胞中进行蛋白表达试验。将其转染进细胞后,CHO和HEK293细胞经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,并克隆化培养,RT-PCR和Western blot分析显示,培养上清液中有hEPO mRNA和蛋白表达。3.细菌内高效制备重组人促红细胞生成素腺病毒pAD-hEPO载体的研究。将体外真核表达验证正确的人促红细胞生成素基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-cmv中,酶切鉴定后得到重组质粒pShIG和pShEIG。经PmeI酶切线性化,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy的大肠杆菌BJ5183,所获阳性菌落酶切鉴定正确,获得的重组人促红细胞生成素腺病毒载体pAD-IG和pAD-EIG。经过PCR和酶切验证,结果符合预期。4.腺病毒包装和感染兔乳腺上皮细胞试验。腺病毒载体pAD-IG和pAD-EIG经PacI消化后,将大片段纯化后转染HEK293细胞,包装获得腺病毒pAD-IG和pAD-EIG,感染HEK293细胞后表达绿色荧光蛋白,进一步说明腺病毒载体构建正确。将腺病毒pAD-IG和pAD-EIG转染体外培养的兔乳腺上皮细胞, Western blot检测到pAD-EIG感染细胞上清中含有人促红细胞生成素的表达,腺病毒pAD-IG感染细胞上清没有检测到人促红细胞生成素的表达,符合预期。结果表明,腺病毒pAD-EIG可以在兔乳腺上皮细胞表达。5.重组腺病毒pAD-EIG在兔乳腺中高效表达的研究。兔乳腺经过EGTA、PBS和不同浓度BAPBA处理,然后通过乳孔注入腺病毒pAD-EIG和pAD-IG,24 h后收集兔奶,用ELISA试剂盒检测兔奶中的hEPO含量,结果表明BAPBA处理的乳腺分泌乳中hEPO浓度明显高于同等浓度EGTA处理组。用Western blot鉴定乳清中的hEPO,证明腺病毒pAD-EIG转染的的乳腺表达了hEPO。BALB/c小鼠的血液网织红细胞数量对EPO在1IU -10IU/只范围内呈现良好的线性关系,用BALB/c小鼠网织红细胞计数法检测兔乳清中人促红细胞生成素的生物活性为67IU/μg。