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长期研究证明龋病是菌斑在牙齿表面聚集而引起的感染性疾病,变形链球菌族(Streptococci mutans,以下简称S.mutans)作为人类、动物龋病的主要致病因子,对牙面有高度的选择性与亲和力,在口腔中主要分布于牙面。长久以来人们一直试图采用药物控制或预防龋病,但采用的抗生素如青霉素、红霉素或氟化物等,均表现出一定的局限性,因此,寻找一种使用安全并且能有效调理口腔菌群平衡的防龋药物成为研究重点,研究人员开始关注天然产物防龋的研究。现代科学研究表明,茶多酚类物质可有效抑制牙菌斑中厌氧菌的生长。原花青素(Procyanidins, PC)是植物中存在的一类天然多酚化合物,其结构与茶多酚相似,它对S.mutans的抑菌作用及对菌株产酸良好的抑制效果为其在临床预防治疗龋齿,及相关功能性食品的开发提供了广阔的发展空间,但是有关原花青素干预龋齿发生的主要作用途径、分子量大小(聚合度)与作用效果的关系以及作用机理等尚不清楚。本文以高粱外种皮中几种原花青素低聚体为研究材料,通过比较原花青素分子量大小(聚合度)与抑制变形链球菌粘附效果的关系,筛选高活性抑制变形链球菌粘附的原花青素活性成分,在此基础上,探讨其干预变形链球菌粘附的主要途径并期望阐明其作用机理。主要内容及结果如下：1.采用70%乙醇为提取溶剂提取高粱外种皮中的原花青素,经ADS-17大孔树脂纯化获得高粱原花青素(Sorghum procyanidins, SPC)粗提物,由Toyopearl HW-40凝胶色谱分离后结合紫外分光光度法(UV)检测得到SPC不同级分,结合Electrospray Ionization-Mass Spectroscopy (ESI-MS)和Reverse phase high-performance liquid chromatography-Mass Spectroscopy/Mass Spectroscopy (RP-HPLC-ESI-MS)对SPC和SPC各级分进行分离鉴定。纯化后SPC纯度为98.5%(正丁醇-盐酸法测定),经ESI-MS分析发现：SPC主要是由儿茶素/表儿茶素单体、原花青素二聚体、三聚体和四聚体组成的混合物。凝胶色谱分离后的4个SPC级分(SPC-U、SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ)通过UV和RP-HPLC-ESI-MS/MS分析发现：除SPC-U为黄酮类物质外,SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ分别为原花青素二聚体、三聚体和四聚体(以下用SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ代替)。2.OD值检测结果表明浓度为1.0mg/mL的SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ均表现出较强抑制S.mutans Ingbritt(c)在倾斜玻璃表面粘附的能力,与对照组比较均有极显著差异(P<0.01),其中SPC-Ⅲ的抑制效果最显著。SPC-Ⅰ浓度范围：0.01～0.05mg/mL, SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ浓度范围：0.002～0.02mg/mL时,抑制S.mutans Ingbritt(c)在倾斜玻璃表面粘附OD值与对照组比较均有极显著差异(P<0.01),表明SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ皆具有明显抑制S.mutans Ingbritt(c)在倾斜玻璃表面粘附的浓度效应关系,且测得IC50值分别为0.033,0.016,0.012mg/mL,提示SPC-Ⅲ的抑制能力最强。在此基础上为进一步探求原花青素干预S. mutans Ingbritt(c)在羟磷灰石(SHA)表面粘附的主要作用途径,采用荧光标记法,同时设置NaF作为阴性对照,结合制备的SPC粗提物及SPC-Ⅰ、SPC-Ⅱ和SPC-Ⅲ,在7.8125-500.0gg/mL浓度范围内分别处理S.mutans Ingbritt(c)和唾液在羟磷灰石表面形成的获得性膜,结果显示：处理S.mutans Ingbritt(c)时,随着5种活性成分浓度的升高,它们对S. mutans Ingbritt(c)在SHA上的粘附抑制率呈上升趋势,其中SPC-Ⅲ的抑制能力最强为67.76%,且在最高4个浓度时,各活性成分每个浓度下的荧光强度与对照组比较均有极显著差异(P<0.01),显示明显的浓度效应关系；处理获得性膜时,随着活性成分浓度的升高,表现出一定的浓度效应关系,其中SPC-Ⅲ的抑制率最高,但是最高浓度抑制率均低于35%,表明处理获得性膜时效果不如处理S.mutans Ingbritt(c)时明显。结果提示原花青素干预S.mutans Ingbritt(c)在SHA表面粘附的主要途径可能是通过与菌表面粘结素作用而产生,尤其SPC-Ⅲ的抑制效果明显优于另外4种药物。3.以S.mutans Ingbritt(c)为实验菌株,采用60%(NH4)2SO4粗提培养基上清液中菌蛋白,采用等电点沉淀法纯化菌蛋白中的葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase, GTFs),同时结合考马斯亮蓝法、Somogyi法和苯酚-硫酸法进行目标蛋白的蛋白质含量、酶活和产多糖能力的检测,得到Initial以及pI为3.10和3.40的3个组份蛋白。分别经过Sepharose6B凝胶柱进行进一步纯化,得到In-Ⅰ和In-Ⅱ、3.10-Ⅰ和3.10-Ⅱ以及3.40-Ⅰ和3.40-Ⅱ共6个蛋白组分,性质测定后推测其中3.10-Ⅰ更可能是具备GTFs活性的目标蛋白组分。通过SDS-PAGE检测6个蛋白组分分子量大小,发现均是含有35-170KD不同分子量蛋白的混合物。MALDI-TOF-MS分析3.10-Ⅰ组分170KD的蛋白条带,检索得到的蛋白成分可信蛋白有10个,其中150KD左右匹配蛋白有4种,源于与变形链球菌同属变形菌门、β-变形菌纲的其他菌种。4.紫外光谱结果显示随SPC-Ⅲ溶液浓度的增大,3种类GTFs蛋白(3.10、3.10-Ⅰ和3.10-Ⅱ)的紫外吸收光谱均发生变化,红移幅度依次变大,有明显增色现象,表明SPC-Ⅲ与目标蛋白发生明显的相互作用。SDS-PAGE结合MALDI-TOF-MS分析目标蛋白之一(3.10-Ⅰ)与4mg/mL SPC-Ⅲ作用前后位于170KD处的两个蛋白条带,检索得到的蛋白成分可信蛋白中有2种分子量为153462Da和153246Da的蛋白相同,与变形链球菌GTFs蛋白分子量最为接近,推测其可能与GTFs具有同样功能或为其中一种。双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)和MALDI-TOF-MS分析类GTFs蛋白(3.10-Ⅰ和3.10-Ⅱ)分别与SPC-Ⅲ作用前后灰度值大的蛋白点,结果显示所有差异点均为变形链球菌家族中的不同蛋白酶类,其中A24为外膜蛋白,在全细菌库中检索出,推测该蛋白是一种同源蛋白或是是以前未在变形链球菌中检测出的一种新蛋白。