研究背景及目的自1982年“脂毒性”的概念提出后,越来越多的基础和临床研究均显示脂质代谢异常是慢性肾病发生和发展的主要危险因素之一。这一血脂的代谢异常以甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白的水平升高,高密度脂蛋白水平降低,以及载脂蛋白谱的改变为主要特点,其中以甘油三酯及胆固醇的升高最为显著。有报道证实,对已经存在基础肾病的患者,血脂异常可导致肾功能的恶化。非糖尿病患者如出现白蛋白尿以及血甘油三酯和胆固醇水平升高,其发生肾功能衰竭的机率明显高于血脂正常患者。而近年来的研究认为,血脂异常和原发性肾病的发生也有一定的相关性。脂代谢紊乱导致的肾损伤可早于糖尿病和高血压的出现。研究显示,高脂饮食诱导的系膜细胞增生、脂质沉积、肾小球系膜基质扩张、细胞外基质积聚以及巨噬细胞浸润等被认为是肾小球硬化以及间质纤维化发展过程早期的病理特征。而微量蛋白尿的出现是肾功能受损的最早标志。脂代谢紊乱相关的肾损害机制复杂,目前认为肾血流动力学改变、内皮功能障碍、胰岛素抵抗、低水平慢性炎症、氧化应激等参与了这一肾损伤过程,导致结构和功能紊乱。然而具体的病理生理学机制仍未完全阐明。随着全球高脂血症患病率的持续升高,与之相关的并发症也日益受到关注,包括血脂异常相关的肾病,因此如何对其进行有效的防治逐渐成为临床关注的热点之一。DPP-4(dipeptidyl peptidase-4)抑制剂西格列汀作为新一类的降糖药,主要通过增加生理浓度的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)起作用。GLP-1是由位于肠道的内分泌细胞L细胞分泌的一种肽类激素,是目前已知最强的刺激胰岛素释放的物质之一,通过与GLP-1受体结合起作用,调节多种生理生化反应。机体内的GLP-1可被DPP-4水解,其是体内外主要促使GLP-1降解、失活的关键酶,广泛存在于机体多个组织器官,以肾脏中的表达最多。而西格列汀可通过竞争性结合DPP-4的活化基团对其起到抑制作用,降低酶的催化活性,使生理浓度的GLP-1水平升高。单独使用西格列汀或联合其他口服降糖药均可有效控制2型糖尿病患者的血糖,降低糖化血红蛋白(HbAlc)。西格列汀主要作用机制包括：1、GLP-1作用于胰岛p细胞,增加胰岛素的生物合成,血糖依赖性的促进胰岛素分泌。反之,当血糖浓度低于4.5mml/L时,GLP-1对胰岛p细胞则基本不会产生上述作用；2、GLP-1对胰岛α细胞也有作用,血糖升高时抑制其分泌胰高血糖素,同时减少肝糖原的分解和输出,增加外周组织对葡萄糖的摄取,提高胰岛素敏感性；而在血糖浓度较低时,则增加胰高血糖素分泌,升高血糖。故服用西格列汀期间低血糖发生率低；3、保护胰岛p细胞功能,刺激其增殖分化,增加p细胞数量,抑制凋亡；4、GLP-1还可作用于中枢系统,产生饱腹感,导致食欲下降,减少食物的摄入,减轻体重；5、抑制胃肠道蠕动,减少胃液分泌,延缓胃的排空,利于餐后血糖的控制。同时西格列汀升高GLP-1浓度还具有独立于改善血糖之外的保护效应,如改善左心室功能和血管内皮舒张功能、抗动脉粥样硬化、减轻非酒精性肝硬化。近期研究显示,西格列汀的这一独立保护作用可能与GLP-1对腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)的磷酸化水平上调有关。然而西格列汀对血脂异常相关的肾损伤是否有相同的保护效应及潜在的机制尚不清楚。AMPK作为细胞内能量和氧化还原反应的感受器,其活性与细胞内能量状态及机体代谢应激状态密切相关。AMPK信号通路活化可参与脂联素对肝细胞的调节作用,减轻肝组织脂肪变性,高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝与AMPK的磷酸化减弱有直接关系。高糖可显著降低AMPK磷酸化水平,介导肾损伤。并且近期发现,AMPK在高脂饮食导致的早期肾病中也有作用,在高脂饮食刺激下,磷酸化AMPK活性受抑制,引起脂质沉积、系膜基质积聚、肾小球滤过屏障受损以及蛋白尿的出现等。既往研究发现,转录生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在多种肾损伤的发生与发展过程中都有重要作用。葡萄糖代谢紊乱、糖化血红蛋白升高、肾小球内压增加以及氧化应激等均可刺激肾组织中TGF-β1的过表达,引起肾小球系膜基质扩张、刺激细胞外基质(extracellular mesangial, ECM)成分FN (fibronectin)和胶原表达增加,导致ECM的集聚、肾小球硬化。而肾间质中弥漫性的TGF-β1表达增加可导致间质纤维化,与肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)下降、尿白蛋白排泄率增加,以及肾功能异常也有明显的相关性。在高糖诱导的大鼠系膜细胞中发现,TGF-β1、FN以及胶原作为AMPK的下游信号,AMPK活性增强后可抑制其表达,发挥独立与血糖的肾保护作用。此外,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen Activated Protein Kinase, MAPK)作为细胞内信号转导的主要通路,同时也是TGF-β1信号的下游重要组成成分。其中,p38是MAPK通路中的应激信号通路,在肾脏组织中,p38主要介导和调控细胞的肥大、增殖、以及凋亡。相关研究证实,阻断p38/MAPK通路后可减少系膜基质扩张以及胶原和FN的表达,延缓肾小球硬化和肾间质纤维化。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)作为MAPK家族的另一成员,被激活后也可引起肾小球中胶原蛋白的合成增多,直接参与肾小球细胞外基质的重构。基于上述研究结果和理论基础,我们设计了本实验。在实验过程中,选择和建立理想的动物模型是两个重要的环节。作为经典的血脂异常模型,载脂蛋白E (apolipoprotein, apoE)基因敲除小鼠(apoE-/-)广泛应用于非酒精性肝硬化、动脉粥样硬化等心血管疾病的研究中。富含大量脂肪和胆固醇的高脂饮食能加速apoE-/-小鼠脂代谢紊乱的出现,诱导肾组织损伤。而由于载脂蛋白E基因缺陷,降脂药物对apoE-/-小鼠的血脂异常没有明显的改善作用,同时为期16周的喂养过程中可不出现血糖水平异常,从而可独立观察西格列汀对血脂异常相关性肾损伤的保护作用。我们以apoE-/-小鼠为实验对象,首先建立肾损害模型,观察小鼠出现的代谢紊乱特点及肾脏损伤表现。其次在是否进行药物干预的不同组中均检测相关指标,观察药物治疗效果,明确西格列汀对血脂异常相关性肾损伤的保护作用。最后我们进一步提取了模型小鼠的肾脏组织蛋白进行研究,检测组织中AMPK、 TGF-β1、FN以及p38/ErkMAPK信号通路的表达,推测西格列汀这一保护作用的可能机制,为其临床意义提供实验证据。基于上述研究背景和理论依据,本实验的内容包括：1、繁殖并鉴定apoE-/-小鼠。2、以高脂饲料喂养16周,诱导小鼠肾损伤。3、观察西格列汀对小鼠代谢紊乱,以及肾功能和结构损伤的影响。4、检测应用西格列汀治疗后,肾组织中相关指标mRNA及蛋白及表达的改变。方法(1)取6周龄雄性apoE-/-小鼠及C57BL小鼠,予纯水及普通饲料适应性喂养2周,自8周龄起,将apoE--/-小鼠随机分为apoE-/-组(高脂饲料,n=10)、sig+apoE-/-组(高脂+西格列汀饲料,n=7), C57BL小鼠(高脂饲料,n=8)设置为control组,三组喂养时间均为16周。实验期间,每周以电子天平称重并记录小鼠的体重变化；实验第15周及第16周,分别行腹腔糖耐量实验(IPGTT)和腹腔胰岛素耐量实验(IPITT)观察小鼠血糖水平及胰岛素敏感性。实验16周后,将小鼠置于代谢笼,收集24小时尿标本,用ELISA法检测小鼠24小时尿白蛋白和尿8-羟基脱氧鸟苷浓度,观察小鼠肾功能损伤和氧化应激损伤。随后行小鼠腹腔麻醉,眼球摘除取血,4℃冰箱静置2h以上,低温高速离心机离心后取上清测定血脂水平。(2)取血后脊柱离断处死各组小鼠,快速称取肾重。另一侧肾脏置于冻存管中,-80℃冰箱保存。一侧肾脏延纵轴切开分为两部分,分别以4%甲醛浸泡24-36h或以液氮冷冻后,对肾皮质进行石蜡包埋及冰冻包埋,制备切片行过碘酸雪夫(PAS)染色、天狼星红染色(Sirus red)和油红O (Oil red O)染色,观察小鼠肾小球系膜基质面积、脂质沉积面积和胶原面积。光镜下观察组织染色切片,每个样品随机选取5个高倍镜(400x)下视野,应用Image-Pro Plus软件计算肾小球系膜基质面积、肾小球脂质沉积面积以及肾间质胶原面积,进行统计分析。(3)以GAPDH为内参标化,real-time PCR方法检测肾皮质中GLP-1受体(GLP-1R)、DPP-4、TGF-β1、FN-1mRNA的相对表达量。裂解肾皮质组织,匀浆提取组织mRNA,酶标仪测定样品RNA浓度后,加入逆转录体系,合成cDNA。合成后的cDNA以无酶去离子水稀释10倍后,再加入PCR反应体系,进行目的基因的PCR反应。反应结果以对照组GAPDH值校正,进行统计分析。(4)裂解肾皮质组织,匀浆提取组织总蛋白,酶标仪测定组织总蛋白浓度,制作标准曲线,计算并确定上样量。在组织蛋白样品中以4：1的比例加入6xloading buffer,煮沸5分钟蛋白变性,将样品加至10%的SDS凝胶中进行Western blotting实验。检测AMPK、磷酸化AMPK、TGF-β1、FN、p38、磷酸化p38、Erk、磷酸化Erk蛋白的表达。应用Gelpro32软件测定各组目的蛋白的灰度值,以β-actin为内参标化,计算目的蛋白相对表达量,进行统计分析。(5)统计：实验所得结果中,服从正态分布的计量资料均以“均数±标准差(mean±s.d.)"表示,应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计描述和统计分析。对符合完全随机设计的多组样本均数,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验。当总体方差齐时,采用LSD-t检验进行多个样本均数的两两比较；方差不齐时先用Welch法矫正,再采用Dunnett T3法进行多个样本均数的两两比较。P<0.05表示差异显著,具有统计学意义。结果(1)各组小鼠体重呈现持续增长并存在显著差异(F=14.871,P<0.001)。自实验第1周起至实验结束,apoE-/-组小鼠体重较对照组相比均明显升高,差异具有统计学意义(P=0.002)；而apoE-/-组和sig+apoE-/-组间体重在各时间点均没有显著差异(P>0.05)。实验16周后血脂检测显示,apoE-/-组和sig+apoE-/-组小鼠甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)均显著高于对照组(P<0.01), apoE-/-组和sig+apoE-/-组间上述指标没有统计学差异(P>0.05),而高密度脂蛋白(HDL)在apoE-/-组(P<0.001)及对照组(P<0.001)均显著低于sig+apoE-/-组。IPGTT结果显示,apoE-/-组、sig+apoE-/-组和对照组三组间空腹血糖水平均没有显著差异(F=1.947,P=0.177)。而IPITT结果显示,apoE-/-组小鼠腹腔注射胰岛素15、30、60min后血糖值较对照组均明显升高(P<0.05), sig+apoE-/-组30min (P=0.023),60min (P=0.012)后的血糖值明显低于apoE-/-组,差异具有统计学意义。(2)24小时尿液检测结果显示：apoE-/-组24小时尿白蛋白(ALB)排泄量明显高于sig+apoE-/-组(24.074±2.940vs16.510±3.583,P<0.001)和对照组(24.074±2.940vs18.475±2.859,P=0.003),差异具有统计学意义(F=10.613,P=0.001)。同时三组间24小时尿中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)排泄量存在显著差异(F=10.613, P=0.001)。apoE-/-组与对照组相比,8-OHdG明显增加(39.127±7.064vs26.842±4.656,P=0.001),而在sig+apoE-/-组8-OHdG较apoE-/-组显著减少(39.127±7.064vs28.883±3.359,P=0.003)。(3)肾皮质组织切片染色结果显示,与对照组相比, apoE-/-组PAS阳性染色面积(27.174±2.333vs8.341±1.079, P<0.001)、天狼星红阳性染色面积19.428±1.796vs3.221±0.775, P<0.001)、油红O阳性染色面积(20.130±1.678vs4.041±0.889,P<0.001)均明显增加(F=168.527,P<0.001),差异具有统计学意义。而与apoE-/-组相比,sig+apoE-/-组PAS阳性染色面积(P<0.001)、天狼星红阳性染色面积(P<0.001)、油红O阳性染色面积(P<0.001)明显减少。(4) real-time PCR检测显示：apoE-/-组小鼠肾皮质中,TGF-β1(P<0.001)和FN-1(P=0.028) mRNA表达水平较对照组小鼠均显著升高。而与apoE-/-组相比较,西格列汀能显著抑制TGF-β1(P<0.001)口FN-1(P=0.004) mRNA的表达。apoE-/-组、sig+apoE-/-组、对照组三组间的GLP-1R(F=0.512, P=0.609)和DPP-4(F=1.941, P=1.178) mRNA表达水平没有统计学差异。(5) Western blotting检测显示,apoE-/-组小鼠肾组织phospho-AMPK蛋白表达水平显著低于对照组小鼠(P<0.001),西格列汀可显著上调phospho-AMPK的表达(P=0.001)。同时,apoE-/-组小鼠TGF-β1(P<0.001)、FN (P<0.001)、 phospho-p38(P=0.014)、phospho-Erk (P<0.001)蛋白表达水平显著高于对照组,西格列汀治疗后可明显抑制TGF-β1(P<0.001)、FN-1(P=0.002)、phospho-p38(P=0.037)、phospho-Erk (P<0.001)蛋白的表达。结论本实验探讨了西格列汀对在体动物模型血脂异常相关肾损伤的保护作用,并在分子水平对其作用机制作出部分研究。通过实验得到以下结论：1、西格列汀给药16周,对高脂饲料喂养的apoE-/-小鼠体重、血糖及血脂水平无明显影响。西格列汀可提高apoE-/-小鼠的胰岛敏感性,改善小鼠肾功能,减轻氧化应激损伤,并显著减少肾小球系膜基质扩张、肾小球脂质异常沉积以及肾间质胶原纤维增生。提示西格列汀对血脂异常相关性肾损伤具有保护作用,2、西格列汀可通过上调肾皮质phospho-AMPK的表达,改善细胞能量代谢紊乱。同时抑制TGF-β1、FN及p38/Erk MAPK信号通路,延缓肾小球硬化、肾间质纤维化的发生和发展,这可能是对血脂异常相关性肾损伤发挥保护作用的潜在机制。