论文部分内容阅读
本研究采用细胞外基因操作方法构建了扩展青霉碱性脂肪酶(Penicilliumexpansum 1ipase，PEL)多拷贝表达质粒，并将表达质粒转化巴斯德毕赤酵母构建成多拷贝基因工程菌，有效地提高了PEL在巴斯德毕赤酵母中的表达水平。三拷贝工程菌的蛋白表达量达800μg／ml，脂肪酶活性达1199U/ml。酶活比本课题组最初构建的工程菌提高了3.6倍。本研究还利用定点突变技术对PEL进行了分子突变，获得了一株热稳定性好，最适作用温度比野生型降低了10.0℃的低温突变体。1.PEL多拷贝工程菌的构建及表达将PEL的编码基因lip克隆进毕赤酵母表达载体pA0815，构建出1-4拷贝表达载体pA0815-xlip(x=1,2,3，4)。pA0815-xlip电转化毕赤酵母GS115后，通过筛选获得了多拷贝工程菌GS-pA0815-xlip。对GS-pA0815-xlip进行甲醇诱导表达，以SDS-PAGE分析表达产物并测定其活性，结果表明：4种多拷贝工程菌均能分泌表达脂肪酶，表达蛋白均占分泌蛋白的95％以上；其中，3拷贝的蛋白表达量(8001μg/ml)和脂肪酶活性(1199U/ml)最高，与单拷贝相比，分别提高了约73.9％和77.6％，酶活比本课题组最初构建的工程菌(260J／ml)提高了3.6倍，有效地提高了PEL基因在毕赤酵母中的表达水平。对3拷贝的发酵条件优化结果表明：发酵培养基最适起始pH为8.0，最适的甲醇诱导起始菌体密度为1.0(A<,600>)，最适甲醇诱导浓度为1.5％，最适诱导时问为120h。
2.PEL的定点突变
采用重叠延伸PCR的方法对PEL基因进行了PXD、P150S、1164A的定点突变及PXD与高产突变体ep8的叠加突变，采用大引物PCR法进行了P239A的定点突变。将突变基因引入毕赤酵母GSl15中表达，构建了5种突变体。对两种比较突出的突变体的酶学性质研究结果表明：与野生型相比，(1)突变体PEI-PXD-GS最适作用温度下降10.O℃，热稳定性保持不变，表达量约为368.0μg／ml，发酵酶活约为432.OU／ml，比活约为1173.9U／mg；(2)叠加突变体PEL-ep8-PXD-GS的最适作用温度下降10.0℃，热稳定性(Tm)提高0.9℃，表达量约为416.0μg／ml，发酵酶活约为1113．0U／ml，比活约为2675.5U／mg，比野生型提高了约49.1％，具有叠加效果；这两个突变体均比最初构建的低温突变体PEL-P163A-GS具有更好的热稳定性，取得更好的突变效果；(3)突变体PEL-P150S-GS最适作用温度提高10.0℃，热稳定性(Tm)下降5.1℃，比活约下降37.3％；(4)突变体PEL．P239A-GS最适作用温度下降2.0℃，热稳定性(Tm)下降0.8℃，比活下降32.6％；(5)突变体PEL-1164A-GS的最适作用温度没有明显变化，热稳定性(Tm)下降7.1℃，比活下降29.3％。