藿香正气口服液干预湿困脾胃证代谢组学及肠道菌群研究

来源 :广东药科大学 | 被引量 : 10次 | 上传用户:peiyingbin
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本研究采用基于核磁共振(1H-NMR)和超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-QTOF/MS)的代谢组学技术及16S rRNA高通量测序技术研究藿香正气口服液对大鼠湿困脾胃证的干预作用,从代谢网络和肠道菌群角度探讨藿香正气口服液干预湿困脾胃证的作用机制,为藿香正气口服液临床应用提供新的实验证据。主要研究内容如下:第一部分藿香正气口服液干预湿困脾胃证的药效评价将雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和藿香正气口服液给药组。模型组和给药组的大鼠置于自制造模箱内,控制温度为1825℃,湿度为(90±5)%,每日8:0016:00,令大鼠站在4 cm深的水中,单日禁食,每只大鼠灌服4℃冰水2 mL,双日供应充足饲料,每只大鼠灌服熟猪油4mL,共造模20 d。造模第11天,给药组开始灌胃给予藿香正气口服液(10mL·kg-1),连续给药10 d,正常组和模型组的大鼠灌胃等体积生理盐水。结果显示:(1)模型组大鼠出现自主活动减少,体重、体长、尾长、腹围指数下降,结肠组织绒毛脱落,肠腔扩张,肠腺减少,黏膜层和固有层出现严重水肿,脾脏、胸腺系数及血清IgG水平降低,IL-6水平升高,以上结果表明模型建立成功。(2)藿香正气口服液对湿困脾胃证引起的上述指标具有一定的干预作用。第二部分基于1H-NMR技术的藿香正气口服液干预湿困脾胃证代谢组学研究利用1H-NMR技术测定大鼠血清、尿液和粪便代谢物轮廓;采用正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least-Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)研究湿困脾胃证及藿香正气口服液干预后引起的大鼠代谢表型变化;运用变量重要性投影(Variable Importance in the Projection,VIP)和t检验筛选与湿困脾胃证相关潜在生物标志物。结果表明:(1)藿香正气口服液能有效逆转湿困脾胃证引起的大鼠血清、尿液、粪便代谢表型紊乱,表现为血清(VLDL/LDL、异亮氨酸、3-羟基丁酸、丙氨酸、N-乙酰糖蛋白、谷氨酰胺、肌酸/磷酸肌酸、氧化三甲胺)、尿液(α-酮戊二酸、二甲胺、肌酐、氧化三甲胺、富马酸)和粪便(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙酸、乳酸、乙酸、N-乙酰葡糖胺、β-葡萄糖、α-葡萄糖、尿嘧啶、酪氨酸、苯丙氨酸)中与湿困脾胃证相关的19个潜在生物标志物产生显著的回调。(2)藿香正气口服液干预湿困脾胃证的代谢通路主要涉及三羧酸循环、脂质代谢、氨基酸代谢及肠道菌群代谢。第三部分基于UPLC-QTOF/MS技术的藿香正气口服液干预湿困脾胃证代谢组学研究利用UPLC-QTOF/MS技术在正、负离子模式下测定大鼠血清代谢物轮廓;采用OPLS-DA研究湿困脾胃证及藿香正气口服液干预引起大鼠代谢表型变化;VIP和t检验筛选与湿困脾胃证相关潜在生物标志物。结果表明:(1)在正离子模式下筛选出9个与大鼠湿困脾胃证相关的潜在标志物(组胺、谷胱甘肽、鹅去氧胆酸、LysoPE(16:0/0:0)、LysoPC(14:0)、LysoPE(20:3)、L-丝氨酸、N-Acetyglutamine、鞘氨醇),在负离子模式下筛选出6个潜在生物标志物(Cysteine-S-sulfate、脱氧胞苷、S-Methyl-5,-thioadenosine、PS(18:0)、磷酸胆碱、芥酸)。(2)藿香正气口服液能使除L-丝氨酸、N-Acetyglutamine、鞘氨醇、磷酸胆碱、芥酸外的10个潜在生物标志物产生显著回调。藿香正气口服液干预湿困脾胃证的代谢通路主要涉及氨基酸代谢、胆汁酸代谢、磷脂代谢。第四部分基于16sRNA高通量测序的藿香正气口服液干预湿困脾胃证肠道菌群研究基于Illumina HiSeq测序平台,利用16S rRNA高通量测序技术研究大鼠粪便肠道菌群结构与组成的变化。通过双末端测序(Paired-End)的方法,构建小片段文库进行测序;通过对Reads拼接过滤,OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类,并进行物种注释及丰度分析,揭示样品的物种构成;通过PcoA及方差分析(ANOVA),t检验发现样品间潜在的菌群标志物。结果表明:(1)湿困脾胃证能引起大鼠肠道菌群结构与组成的变化,使菌群多样性下降。(2)在门水平找到4种与湿困脾胃证相关的潜在菌群标志物(蓝藻菌门、软壁菌门、疣微菌门、拟杆菌门)和属水平找到4种与湿困脾胃证相关的潜在菌群标志物(节杆菌属、棒状杆菌属、丁酸弧菌属、库特氏菌属)。藿香正气口服液能有效干预湿困脾胃证引起的大鼠肠道菌群紊乱,并使之逐步恢复到正常状态。
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