TRK（tropomyosin receptor kinase,原肌球蛋白受体激酶）受体酪氨酸激酶家族包括TRKA、TRKB和TRKC,分别由NTRK1、NTRK2、NTRK3基因编码。NTRK基因融合是多种小儿及成人癌症的驱动因素,NTRK融合基因编码的TRK融合蛋白可以不依赖配体地组成性激活,促进肿瘤细胞的增殖和存活。第一代TRK抑制剂拉罗替尼、恩曲替尼治疗NTRK融合阳性癌症患者的反应率较高且总体安全性良好,但TRK突变介导的耐药不可避免地快速发生,主要包括溶剂前沿、守门员残基和x DFG基序等位置的氨基酸点突变等。处于临床研发阶段的第二代TRK抑制剂LOXO-195、TPX-0005等虽然提升了对野生型TRKA/B/C激酶的活性,且能克服溶剂前沿突变耐药,但均不能克服x DFG基序突变耐药。本研究构建了23种携带NTRK融合基因的Ba F3细胞模型,涵盖TRKA/B/C野生型及多种耐药突变。通过组内化合物筛选,我们发现JND4135具有n M级别的野生型TRKA/B/C激酶抑制和亲和活性,其在<20 n M水平对野生型及多种点突变Ba F3-TRK细胞都表现出良好的增殖抑制活性,尤其是对x DFG基序突变有效,同时对溶剂前沿突变活性与LOXO-195相当。468种激酶筛选实验发现,JND4135是一个选择性较好的、强效的TRK抑制剂。JND4135对野生型TRKA/B/C的Kd分别为0.079 n M、0.29 n M、0.46 n M,IC50分别为6.966 n M、6.018 n M、3.006 n M。流式分析表明,JND4135在10 n M浓度下即可以诱导Ba F3-CD74-NTRK1-G667C细胞发生显著的G0/G1期阻滞与凋亡。WB实验表明,JND4135能够剂量依赖性地抑制野生型及多种耐药突变的Ba F3-TRK模型细胞中TRK及其下游信号通路的磷酸化。分子对接表明JND4135能够与野生型、溶剂前沿及x DFG突变的TRKC蛋白的DFG-out构象稳定结合,该构象中突变位点不影响其与靶蛋白的结合。分子互作实验表明,JND4135与TRKC、TRKCG696C蛋白的相互作用均呈现出慢结合、慢解离的特点,两者Kd值接近,明显区别于已上市及其他在研的TRK抑制剂。我们还发现了JND4135能够招募E3泛素连接酶RNF123,并通过蛋白酶体途径快速诱导EVT6-TRKC融合蛋白降解,但EVT6-TRKC会快速再合成并代偿JND4135的降解作用。体内研究显示,JND4135的药代动力学性质不佳,Cmax、BA等较低;腹腔给药条件下,JND4135在20 mg/kg剂量下对Ba F3-CD74-NTRK1-G667C细胞小鼠移植瘤模型的抑瘤率为75%,40 mg/kg剂量可以完全消除移植瘤;同时发现上述剂量均能显著延长荷瘤小鼠的生存期。JND4135能够有效抑制肿瘤组织中TRKA、PLCγ1的磷酸化。实验过程中,JND4135对小鼠体重影响不大,未见其他毒副作用。综上所述,我们基于Ba F3细胞建立了23种携带不同TRK突变体细胞模型,筛选并首次发现并鉴定JND4135能够体内外克服现有报道的一二代TRK抑制剂均无效的x DFG及其他突变耐药,并发现其独特的结合模式及TRKC的降解作用,但JND4135的PK性质较差,需要进一步结构改造以提高其成药性。