/番木瓜(carica papaya)为多年生草本果树,原产于中美洲,是热带和亚热带地区较为常见的一种农作物,在我国的海南、广东、广西、台湾、云南等省份有较大的种植面积。番木瓜的树干、果实、根部及种子等部位存在着大量的木瓜蛋白酶类及脂肪酶类,这些酶类统称为木瓜酶粗酶,商品名为木瓜蛋白酶。其生产方法简便,用工具切割未成熟的青果即可收集得到大量的木瓜酶粗酶,其中以未成熟的青果果实浆液中酶的含量最为丰富,木瓜酶粗酶含量占其质量的15%。这一类木瓜酶粗酶在医药、食品、制革、纺织及美容等领域具有广泛的应用。同时番木瓜种植广泛,为大规模生产以上酶类提供了丰富的原料来源。因此开发木瓜源酶类具有重要的应用价值。本论文主要做了一下工作：第一部分,由于已经广泛应用的木瓜酶均为粗酶,粗酶里含有多种水解酶类,是多种酶类的混合酶,因此限制了其在医药、手性催化、美容等高端精细领域的进一步应用,因此论文首先对木瓜酶粗酶中的重要酶类-木瓜蛋白酶及脂肪酶进行了分离纯化。木瓜脂肪酶由于是天然固定化的脂肪酶,在水中的溶解度低,因此通过将木瓜酶粗酶重新溶解于pH7.5的磷酸缓冲液中,离心分离得到易溶于水的木瓜蛋白酶类溶液和不溶于水的木瓜脂肪酶类(CPL)沉淀两部分,实现蛋白酶类与脂肪酶类的有效分离。接着制备了CPL的冻干粉制剂,并对其性质、应用领域进行研究。在木瓜酶粗酶中CPL是与未知的类似于纤维的干物质紧密结合在一起的,被认为是一种天然固定化的脂肪酶,其水溶性差,因此通过多步缓冲液提取能够将木瓜蛋白酶类与木瓜脂肪酶实现有效的分离。最终经过多步缓冲液提取、离心、冷冻干燥成功制备了CPL酶制剂,冷冻干燥后得到的CPL质量占粗酶干重的15%,并对冷冻干燥过程中影响酶活的关键因素进行了优化,通过测定其水含量,得出酶保持其活力最佳的水含量为2%,冷冻干燥时间为8h。制备得到CPL酶制剂后,我们对CPL的酶学性质进行了研究,CPL基本酶学性质的研究内容主要包括：CPL水解活力的测定,CPL的最适温度、pH、热稳定性、有机溶剂耐受性,催化羧酸与醇的酯化反应过程中CPL对羧酸和醇碳链长度的选择性等等,实验结果表明CPL具有优良的热稳定性、有机溶剂耐受性,非常适合其在非水相体系中的应用。如CPL在65℃保温6h后其活力仍然保持在90%以上,CPL能够催化羧酸与醇直接脱水酯化合成脂肪酸酯,并且对中等碳链长度的羧酸和醇具有较高的酯化活力,由于脂肪酸酯也是重要的香精香料,因此对底物性质的酶学考察不仅具有学术价值,同时具有重要的应用价值。第二部分,在以上实验基础上重点考察了CPL在生物催化领域,特别是利用生物催化制备在食品、医药领域具有重要价值的化合物。首先利用CPL在有机溶剂中催化合成了在食品、化妆品、香水中广泛使用的一类香料酯-萜烯醇酯。通过实验发现CPL在有机溶剂正己烷中能够高效催化香茅醇与辛酸乙烯酯反应合成香茅醇辛酸酯,通过优化确定最优的条件为：底物摩尔比1：1,反应温度55℃,水活度为0.32,酶加入量为50mg,经过8h反应转化率接近100%。并对其反应动力学进行了研究,测得其对底物香茅醇和辛酸乙烯酯的Km值分别为821.7mM,30.9mM,反应得机制为带有底物抑制的Ping-Pong Bi-Bi机制,当底物香茅醇浓度超过0.6M时会对反应产生抑制作用。第三部分,重点考察了CPL在手性医药中间体制备和手性药物拆分中的应用。考察了CPL对文献报道中脂肪酶拆分常见的仲醇、羧酸、氨基酸等三类底物的拆分效果。利用脂肪酶制备在不对称合成中具有重要作用的手性中间体,是目前脂肪酶应用研究的重要领域。通过建立合适的反应体系,对影响拆分反应的关键因素包括反应温度、溶剂、酰基供体碳链长度、底物摩尔比等进行了优化,成功实现了对一类重要的手性中间体-芳香仲醇的拆分。在正己烷溶剂中,30-55℃范围内,以乙酸乙烯酯类活性酯作为酰基供体,底物与酰基供的摩尔比为2：1时,经过30小时反应,底物4-苯基-2-丁醇的转化率为49.5%,底物e.e值为99.4%,反应的E值大于200。对其结构类似物a-苯乙醇、1-苯基-2-丙醇的拆分进一步表明CPL对这类芳香仲醇具有较好的拆分效果。CPL不仅可以催化制备手性中间体,同时还可直接用于手性药物的拆分,利用酶对外消旋体药物进行手性拆分,是目前制备手性药物比较常见同时也比较经济的一种方法。布洛芬类药物是临床上应用较为广泛的一类非甾体类消炎药,其不同构型具有不同的药理特性,因此制备单一构型药物对提高药效,减少毒副作用具有重要意义。选取这类药物作为底物研究CPL在外消旋体药物拆分中的应用。通过对一系列底物的拆分表明CPL对这类底物均具有较好的拆分能力,对萘普生的拆分效果最好,经过30小时反应转化率达到49%,反应的E值为173,对一系列化合物的拆分结果表明2位上空间位阻较大的底物比空间位阻小的化合物具有更好的拆分效果。动力学分析证明,CPL对消旋化合物不同构型底物具有拆分能力,是由对不同构型底物反应速率差异产生的,而反应速率差异是由于酶反应过程中酶-底物中间体生成酶、产物这一过程中K2s、K2R不同造成的,而不是由于不同构型的KM值差异产生的。对于萘普生：K2R/K2s的比值为195,数值接近反应的E值。CPL不仅可以催化拆分手性中间体或手性药物,同时还可以与化学法结合,利用催化制备的手性中间体作为起始手性源合成手性药物。非天然氨基酸作为一类重要的化合物,其手性单一构型是手性药物合成的手性源砌块。利用CPL对p-苯丙氨酸这一重要非天然氨基酸进行拆分。分别从底物工程、溶剂工程角度对影响拆分效果的因素：氨基保护基团空间大小、氨基位置、羧基酯的碳链长度、类型、苯环上取代基团的影响、醇解反应亲核试剂、亲核试剂浓度、反应温度,反应溶剂等方面对拆分反应进行了系统研究。研究表明对于β-苯丙氨酸,位阻是影响拆分效果的最显著因素,氨基保护基团为空间位阻较小的乙基时效果最好,氨基与苯环的位置越近酶活力越低。其次为底物的电荷性质,苯环上带有吸电子的基团如Cl会显著降低反应速率,反应速率Vs由H的6.40*10-3降为6.80*10-4。通过提高p-苯丙氨酸羧酸酯的离去性,将N-乙酰-p-苯丙氨酸乙酯替换为N-乙酰-β-苯丙氨酸三氟乙酯时显著提高了反应速率及转化率,经过10小时反应转化率为50%,E值230；因此认为底物结构是影响拆分效果最重要的因素。同时反应条件也是影响拆分效果的重要因素：如酰基受体的选择,以浓度为10ul/ml的甲醇做为酰基受体时拆分效果最好,只有一种构型产物生成。对其他反应条件的优化表明,最佳的反应温度、溶剂分别为50℃、正己烷。由于CPL对β-苯丙氨酸具有非常好的拆分效果,因此将反应进行了放大,利用CPL催化拆分得到的(S)-p苯丙氨酸作为手性源,结合化学法成功合成了单一构型的抗抑郁药(S)-达泊西汀。