研究背景乳腺癌(Breast Cancer,BC)是女性恶性肿瘤死亡的重要原因之一,严重威胁着女性的生命健康。近年来,乳腺癌在发展中国家的发病率逐年升高。世界范围内,研究者对乳腺癌进行了大量的科研投入,临床治疗逐渐演变为手术联合系统辅助治疗,包括化疗、放疗及内分泌治疗在内的完整体系。然而,传统治疗手段副作用明显,患者耐受性较低,寻找有效新型乳腺癌治疗方法是提高患者生活质量和预后的关键,也是当前研究的热点和难点。传统中医药在中国具有悠久的历史,并在多种肿瘤治疗领域作为辅助治疗药物广泛应用。槐耳属伞菌类担子菌亚门,最早由李时珍记录于《本草纲目》。近年来,槐耳的抗癌活性开始受到关注,然而其抗肿瘤的作用机制十分复杂,目前尚未完全阐明。本课题中,我们通过三部分对槐耳在乳腺癌治疗中的作用及临床应用价值进行研究。第一部分通过对槐耳处理乳腺癌前后的基因芯片检测结果进行生物信息学分析,成功构建了槐耳调控乳腺癌的共表达分子网络。第二部分通过对槐耳调控乳腺癌的共表达分子网络进一步分析,发现linc00339在槐耳影响乳腺癌的分子网络内占有核心地位,并与大量其他信号分子具有紧密的联系,通过进一步分析选择对linc00339进行深入研究。我们通过细胞学实验和动物实验,证实linc00339可以通过miR-4656/CSNK2B通路影响乳腺癌的增殖和转移。第三部分通过临床数据分析槐耳对乳腺癌患者血清肿瘤标志物和生存时间的影响,我们发现槐耳能降低乳腺癌患者癌胚抗原的水平,延长乳腺癌患者的无病生存时间,这样进一步证明了槐耳在乳腺癌辅助治疗中具有重要地位和广阔的应用前景。第一部分槐耳调控乳腺癌分子网络的构建研究目的1.分析槐耳对乳腺癌细胞分子表达的影响。2.探究槐耳处理后差异表达基因的功能。3.构建槐耳调控乳腺癌的分子网络。研究方法在该部分研究中,我们通过将槐耳处理与未经槐耳处理的乳腺癌细胞进行基因芯片分析,利用R语言中的limma数据包筛选乳腺癌细胞中槐耳处理前后差异表达的lncRNA及mRNA。我们用热图展示差异表达的RNA分子,并对其进行聚类分析。随后,我们利用GO分析及KEGG分析对差异基因的功能进行注释,并对涉及其中的差异基因进行解析。通过加权基因共表达分析(WGCNA),我们建立了槐耳调控乳腺癌的共表达分子网络。研究结果通过对槐耳处理乳腺癌前后的基因芯片检测结果进行生物信息学分析,我们发现槐耳在乳腺癌发生发展过程中的各关键环节均具有重要作用。槐耳能够调控多个细胞内分子通路,其中与DNA修复及细胞周期的关系尤为密切,进一步解释了槐耳的抑癌活性。为更加形象具体的展示槐耳对细胞内各分子的影响,我们通过circos图将槐耳处理后发生明显变化的mRNA以及lncRNA在人类染色体上的位置进行了可视化处理。通过整合槐耳与乳腺癌相关联的各个关键信号分子之间的相互作用,我们建立了槐耳调控乳腺癌的分子网络。研究结论1.槐耳处理与未处理的乳腺癌细胞中存在大量差异表达的lncRNA和mRNA。2.槐耳处理能够调控DNA修复及细胞周期等肿瘤相关通路。3.基于关键差异基因,建立了槐耳调控乳腺癌的分子网络。第二部分槐耳通过linc00339抑制乳腺癌进展转移的研究研究目的1.寻找槐耳调控乳腺癌进展转移的关键lncRNA。2.检测槐耳处理/未处理的乳腺癌细胞中linc00339的表达情况。3.探究linc00339对乳腺癌细胞增殖、转移的作用。4.阐明linc00339在槐耳调控乳腺癌进展转移中的分子机制。研究方法通过对第一部建立的分子网络进行分析,我们发现linc00339在槐耳调控乳腺癌的分子网络中占有核心地位,并与大量其他信号分子具有紧密的联系。我们推测linc00339在槐耳调控乳腺癌的进展转移中发挥重要的作用。在随后的体外实验中,利用实时定量PCR,我们对linc00339是否为槐耳的直接靶点进行了验证。随后通过MTT实验验证了 linc00339对乳腺癌槐耳治疗敏感性的影响。为进一步探索linc00339的下游靶点,我们应用starBase对与linc00339共表达的mRNA进行了 Spearman相关分析。我们通过网络分析工具找到了相关的miRNA并通过荧光素酶实验和实时定量PCR进行了验证。研究结果我们对linc00339在槐耳调控乳腺癌的进展转移中发挥重要作用的预测进行了验证。在槐耳处理后的乳腺癌细胞系中,linc00339的表达量显著降低,而过表达linc00339的乳腺癌细胞对槐耳细胞毒作用的敏感性也明显下降。经网站预测及后续实验验证发现,linc00339可通过海绵吸附作用降低miR-4656的表达(P<0.05),进而上调CSNK2B(P<0.05),促进乳腺癌的增殖。槐耳可以显著抑制linc00339并呈现时间和剂量依赖性(P<0.05),继而通过对linc00339的抑制作用增加miR-4656的表达(P<0.05),最终导致CSNK2B在mRNA水平和蛋白水平均发生显著降低(P<0.05)。上述结果表明,linc00339是调节乳腺癌对槐耳治疗敏感性的关键分子,槐耳可通过调节linc00339/miR-4656/CSNK2B通路抑制乳腺癌的进展转移。研究结论1.Linc00339是槐耳调控乳腺癌进展转移的关键lncRNA。2.槐耳处理可明显降低linc00339的表达水平,且linc00339高表达与细胞对槐耳的敏感性呈负相关。3.体内和体外实验均证实linc00339可以显著提高乳腺癌的增殖、转移能力。4.Linc00339可以通过影响miR-4656/CSNK2B通路而发挥促癌作用。第三部分槐耳治疗乳腺癌的临床研究研究目的1.分析槐耳治疗对乳腺癌患者生存时间的影响。2.分析槐耳治疗对乳腺癌患者血清肿瘤标志物的影响。3.分析槐耳治疗对乳腺癌患者生活质量的改善情况。研究方法本研究纳入了 216名于2005年1月份至2016年10月期间就诊于山东大学齐鲁医院的乳腺癌患者,其中包括接受槐耳颗粒治疗与未接受槐耳颗粒治疗的两组患者。获得的回顾性数据包括人口统计数据、临床病理学特征、无病生存率(DFS)、血清肿瘤标志物浓度等,其中DFS是主要的结果指标。研究结果对照组纳入乳腺癌患者108名,槐耳颗粒治疗组纳入患者108名。两个组别患者的基线特征平衡性良好。对槐耳治疗组与对照组乳腺癌患者的血清进行检测,结果显示槐耳可以显著降低血清中CEA的浓度,而对CA153和CA125没有明显影响。Kaplan-Meier分析发现,槐耳治疗组患者的无病生存期显著长于对照组患者(P=0.0002),因此槐耳治疗可以显著延长乳腺癌患者的无病生存时间。此外,槐耳可以改善乳腺癌患者的睡眠(P=0.02)和食欲(P=0.02),但是在易怒(P=0.99)、记忆力减退(P=0.55)、感到疲劳(P=0.78)等方面无明显差别,因此口服槐耳颗粒可以改善乳腺癌患者的生活质量。上述临床数据证实,槐耳在乳腺癌患者中作为辅助治疗药物具有重要的临床意义和广阔的应用前景。研究结论1.槐耳降低乳腺癌患者血清肿瘤标志物的浓度。2.槐耳明显延长乳腺癌患者的无病生存时间。3.槐耳可以改善乳腺癌患者的生活质量。4.槐耳在乳腺癌的辅助治疗中具有重要地位和广阔的应用前景。