紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆与分析

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本实验以唇形科植物紫苏(Perilla frutescens)为研究对象,首次从紫苏中克隆得到了迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸途径中第二个关键酶肉桂酸4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase, C4H)基因的cDNA和基因组DNA全长序列,cDNA全长命名为PerC4H (GenBank登录号:KM434189),并对该基因进行了生物信息学分析和基因表达分析。通过已报道的唇形科植物黄芩、丹参和藿香的C4H基因序列比对,在保守序列区域设计简并引物,利用RT-PCR技术扩增得到PerC4H基因的部分序列片段,然后利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆得到1667bp的cDNA全长,其中包含1518bp的开放阅读框(ORF),编码505个氨基酸残基,含有长度为21bp的5q}编码区(5’UTR)和93bp的3qE编码区(3’UTR)。并设计全长引物克隆得到该cDNA序列对应的DNA序列全长2087bp,有三个外显子和两个内含子,外显子长度分别为777bp、133bp和731bp,两个内含子的长度分别为376bp和70bp。经BLAST基因比对,得到的紫苏C4H基因的cDNA全长序列与已报道其它物种的C4H基因具有很高的相似性,与唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis)、丹参(Salvia miltiorrhiza)和藿香(Agastache rugosus)核苷酸的一致性分别为86.96%、86.10%和82.81%,编码的氨基酸的一致性为89.55%、92.48%和90.30%。利用生物信息学软件对克隆得到的紫苏C4H基因进行分析,结果表明:其编码的氨基酸是一个亲水性蛋白,不具有跨膜结构域。经NCBI结构域分析表明该基因ORF翻译的氨基酸序列有典型的细胞色素P450家族中c112078亚家族的保守结构域。紫苏C4H蛋白的二级结构预测显示其含有47.92%的α螺旋,12.67%的延伸链,4.36%的β折叠,35.05%的无规则卷曲。对其高级结构进行预测,得到了紫苏C4H蛋白的三维结构模型。C4H系统进化树分析则表明紫苏C4H有明显的种属特性,且紫苏C4H与唇形科植物C4H亲缘关系最近。以紫苏β-Actin基因作内参,采用荧光实时定量PCR方法对C4H基因表达进行分析,结果表明紫苏C4H基因在根中的表达丰度最高,茎中次之,叶中最低。500gMMeJA和250mg/L的赤霉素在一定程度上均上调紫苏C4H基因的相对表达水平,而100μM的ABA和黑暗处理则明显降低紫苏C4H的表达量。对紫苏C4H基因的表达初步探究为进一步的研究该酶与迷迭香酸产量的积累之间的关系的深入研究提供参考。
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