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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪的严重呼吸系统与繁殖障碍疾病,是目前影响养猪业健康发展的最重要疾病之一。当前国内外采用的PRRS检测方法主要以ELISA及PCR为主。这些方法具有快速、省时等优势,但操作复杂、容易出现假阳性、假阴性。因此,建立一个快速、准确、高通量的检测技术平台用以PRRS流行预警至关重要。本论文以出入境生猪为研究对象,在前人的基础上建立了两种实时荧光PCR方法,并在国内首次建立、报道了PCR-DHPLC检测方法,将其用于出入境生猪PRRS的监控检测,对PRRS预警体系的建立和应用进行了探索,并在PRRS的防控中取得良好效果。1.建立PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法以PRRSV美洲株的GP5基因为靶基因,设计引物,调整PCR体系内各组分及循环参数,最终建立PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法。该方法特异性好,与PCV-2、PRV、CSFV等没有交叉反应;灵敏度高达10个拷贝;重现性良好,各重复样品间扩增曲线拟合程度高。2.建立PRRSV和HP-PRRSV双重Taq Man实时荧光PCR方法以美洲株PRRSV的N蛋白基因、HP-PRRSV的Nsp2基因为靶序列,设计2对引物、探针,分别建立美洲株PRRSV和HP-PRRSV的单一Taq Man探针实时荧光PCR检测方法,并在此基础上进一步研究建立了PRRSV和HP-PRRSV的双重Taq Man探针实时荧光PCR检测方法,可以鉴别检测缺失株与美洲株,特异性好,与PCV-2、PPV、CSFV、SIV、PRV和JEV等无交叉反应;灵敏度高,PRRSV美洲株灵高达9.2个拷贝,HP-PRRSV高达56个拷贝;且重复性较好,批内变异系数小于1%,批间变异系数小于3%。3.首次建立PRRSV PCR-DHPLC方法以PRRSV标准株的GP5基因为靶基因,分别设计克隆用引物和PCR-DHPLC检测用引物,在国内首次建立了PRRSV PCR-DHPLC检测方法,该方法特异性、重现性良好,灵敏度高达10个拷贝/单位,将其用于临床检测表明,PCR-DHPLC与Taqman探针Real-time PCR具有同样的检测灵敏度,能检测出常规RT-PCR不能检出的病料,具有较好的适用性。4.所建立的检测技术平台在PRRS流行预警中的应用及出入境生猪PRRS预警体系框架的建立结合本研究所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法、PRRSV和HP-PRRSV单一及双重Taq Man实时荧光PCR法、PCR-DHPLC法以及经典ELISA法构建PRRS监测技术平台,藉此建立进出境生猪PRRS预警体系框架草案,并将其应用于出入境生猪隔离场、养殖场,进行PRRS疫情监控,为PRRS预警体系收集、储备疫情信息,并及时反馈至相关管理部门。较好了解决了PRRS预警系统中监控检测不全面、监控检测措施不当等问题,在PRRS疫情防控中发挥了重要作用。