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变形假单胞菌JUIM01是2-酮基葡萄糖酸(2KGA)生产的主要工业用菌,其糖酸转化率和发酵生产强度相对较高。2KGA是主要应用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠盐生产的一种重要有机酸。针对变形假单胞菌在高温发酵时葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径发生偏转,从而导致发酵目的产物2KGA产率明显降低的问题,本研究以变形假单胞菌JUIM01为研究对象,考察高温胁迫对变形假单胞菌2KGA生物合成的影响,并分别从转录组学和蛋白质组学水平初步揭示变形假单胞菌葡萄糖代谢对高温胁迫的响应机制,以期为2KGA的高效生产及后续的耐高温工程菌株的选育和构建提供一定的理论基础。论文取得以下研究结果:
(1)明确了温度对变形假单胞菌2KGA生物合成的影响。对不同发酵温度下的发酵参数进行了比较,与32℃相比,36℃、40℃下的2KGA产量分别降低了3.8%、10.1%,发酵周期分别降低了5.8%、11.7%,糖酸转化率分别降低了3.9%、10.2%,2KGA生产强度分别提高了2.1%、1.7%,而发酵液pH值的变化趋势基本相同。利用实时荧光定量PCR检测葡萄糖代谢相关基因的转录水平变化,高温胁迫下2KGA合成途径相关基因(gcd、2kgdH、gndL、gndC、gndS)的表达下调;葡萄糖代谢相关转录调控因子的基因(rccR、hexR、ptxS)在40℃下表达差异显著;2KGA分解代谢途径相关基因(kguT、kguK、kguD)随温度升高而表达下调;葡萄糖磷酸化路径相关基因(glk、zwf)则表达上调。高温胁迫下的葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径偏转,发酵温度升高不利于发酵目的产物2KGA的合成。
(2)从转录组学水平初步揭示了变形假单胞菌葡萄糖代谢对高温胁迫的响应机制。采用IlluminaHiseq测序技术分析不同发酵温度(32℃、36℃、40℃)下的差异表达基因,高温胁迫对变形假单胞菌在转录组学水平上产生全局性影响,其中磷酸戊糖途径、三羧酸循环途径、氧化磷酸化途径、泛醌及其它萜醌生物合成途径中的相关差异基因均受到影响较为显著。在高温胁迫下,葡萄糖胞外氧化途径中2KGA合成相关基因表达下调,胞外氧化途径受到抑制;胞内磷酸化途径中葡萄糖磷酸化路径相关基因表达上调,而葡萄糖酸磷酸化路径和2KGA磷酸化路径相关基因均表达下调,使葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径发生偏转;另外,呼吸链中不同组分以及5种末端氧化酶的协调表达可调整其电子传递效率,提高菌株的高温适应性。
(3)从蛋白质组学水平初步揭示了变形假单胞菌葡萄糖代谢对高温胁迫的响应机制。采用TMT定量蛋白质组学技术分析不同发酵温度(32℃、36℃、40℃)下的差异表达蛋白,高温胁迫对变形假单胞菌在蛋白质组学水平上也产生全局性影响。在高温胁迫下,葡萄糖磷酸化路径中Glk、Zwf-1和2KGA磷酸化路径中KguK、KguD的表达上调,葡萄糖酸磷酸化路径和中GntP、GnuK和胞外氧化途径中Gcd、PqqF、PqqD、RibH、BluB、2KGDH的表达下调,从而使葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径发生偏转,导致2KGA产量降低;呼吸链中5种末端氧化酶也在蛋白质组学水平对高温胁迫做出响应。
(1)明确了温度对变形假单胞菌2KGA生物合成的影响。对不同发酵温度下的发酵参数进行了比较,与32℃相比,36℃、40℃下的2KGA产量分别降低了3.8%、10.1%,发酵周期分别降低了5.8%、11.7%,糖酸转化率分别降低了3.9%、10.2%,2KGA生产强度分别提高了2.1%、1.7%,而发酵液pH值的变化趋势基本相同。利用实时荧光定量PCR检测葡萄糖代谢相关基因的转录水平变化,高温胁迫下2KGA合成途径相关基因(gcd、2kgdH、gndL、gndC、gndS)的表达下调;葡萄糖代谢相关转录调控因子的基因(rccR、hexR、ptxS)在40℃下表达差异显著;2KGA分解代谢途径相关基因(kguT、kguK、kguD)随温度升高而表达下调;葡萄糖磷酸化路径相关基因(glk、zwf)则表达上调。高温胁迫下的葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径偏转,发酵温度升高不利于发酵目的产物2KGA的合成。
(2)从转录组学水平初步揭示了变形假单胞菌葡萄糖代谢对高温胁迫的响应机制。采用IlluminaHiseq测序技术分析不同发酵温度(32℃、36℃、40℃)下的差异表达基因,高温胁迫对变形假单胞菌在转录组学水平上产生全局性影响,其中磷酸戊糖途径、三羧酸循环途径、氧化磷酸化途径、泛醌及其它萜醌生物合成途径中的相关差异基因均受到影响较为显著。在高温胁迫下,葡萄糖胞外氧化途径中2KGA合成相关基因表达下调,胞外氧化途径受到抑制;胞内磷酸化途径中葡萄糖磷酸化路径相关基因表达上调,而葡萄糖酸磷酸化路径和2KGA磷酸化路径相关基因均表达下调,使葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径发生偏转;另外,呼吸链中不同组分以及5种末端氧化酶的协调表达可调整其电子传递效率,提高菌株的高温适应性。
(3)从蛋白质组学水平初步揭示了变形假单胞菌葡萄糖代谢对高温胁迫的响应机制。采用TMT定量蛋白质组学技术分析不同发酵温度(32℃、36℃、40℃)下的差异表达蛋白,高温胁迫对变形假单胞菌在蛋白质组学水平上也产生全局性影响。在高温胁迫下,葡萄糖磷酸化路径中Glk、Zwf-1和2KGA磷酸化路径中KguK、KguD的表达上调,葡萄糖酸磷酸化路径和中GntP、GnuK和胞外氧化途径中Gcd、PqqF、PqqD、RibH、BluB、2KGDH的表达下调,从而使葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径发生偏转,导致2KGA产量降低;呼吸链中5种末端氧化酶也在蛋白质组学水平对高温胁迫做出响应。