克伦特罗(clenbuterol,CL)是一种β2-肾上腺素受体激动剂,常用作支气管扩张剂,用于支气管哮喘及肺气肿等呼吸系统疾病所致的支气管痉挛。当其使用剂量达到治疗剂量的5～10倍时,CL可增强肌肉发育,降低脂肪沉积。由于其特殊的生物学功能,常被非法用做饲料添加剂,导致其在畜产品中大量残留。人类食用含有克伦特罗的肉制品后会出现头晕、心悸、手指震颤等中毒症状。近几年,由于食用残留CL肉制品后引起的中毒事件屡屡发生。因此建立简便、快速、灵敏的免疫学检测方法并用于肉制品中CL残留的现场快速检测,从而有效地预防食物中毒的发生是十分必要的。建立免疫学检测方法首先就要制备特异性抗体。CL是一种小分子有机物,本身不具备免疫原性,不能直接用于免疫实验动物,必须将其与大分子载体蛋白偶联,才能刺激动物的免疫机制产生特异性抗体。只有用高纯度的目标抗原免疫动物才有机会得到针对目标抗原的高特异性抗体,但采取普通方法很难制备高纯度的CL与大分子蛋白的偶联物。为了消除或钝化非目标抗原的免疫原性,有效减少非目标抗体的产生,从而使丰度低的目标抗原刺激动物产生相应目标抗体的机率明显增大。本实验利用消减免疫法对小鼠进行免疫实验,通过改变实验用小鼠的免疫应答发生机制,排除或者钝化体液免疫系统对非目标抗原的应答,从而使小鼠免疫应答系统直接靶向目标抗原决定簇,制备出了高特异性的抗CL单克隆抗体。1 CL完全抗原的制备及对BALB/c小鼠的消减免疫利用重氮化法将CL与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备完全抗原CL-BSA,采用紫外分析检测法验证CL-BSA偶联物的成功合成, BSA与CL的偶联比为1:15.8,符合产生较高效价抗体的要求。以免疫原中的干扰物BSA为耐受原, CL-BSA为目标抗原,用消减免疫法免疫BALB/c小鼠,经过免疫耐受阶段, ELISA法测得实验组小鼠获得对BSA的免疫耐受后,进行耐受后免疫。注射三次免疫原后,取鼠尾血,ELISA法测得免疫小鼠血清中的抗CL-BSA抗体效价均为106。消减免疫实验组的5只小鼠中的2号、5号小鼠对耐受原BSA的耐受效果较好。选取2号小鼠,无菌取脾,制备单细胞悬液,进行下一步的细胞融合。2细胞融合及杂交瘤细胞株的建立以PEG4000为融合剂,将SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞融合,将融合后细胞加至前一天铺好小鼠腹腔饲养细胞的96孔细胞培养板孔内。用HAT细胞培养基和HT细胞培养基选择性培养,细胞融合后12-14d,用建立的ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。计算出细胞的融合率为97%,筛选出的杂交瘤细胞的阳性率为8.2%。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆,每次克隆后均用ELISA法进行阳性克隆筛选。经过四次克隆,最终筛选出五株稳定分泌抗CL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为1A2、1B1、1B4、2B12、2C3。对杂交瘤细胞进行了染色体分析:将对数生长期的杂交瘤细胞用固定液固定后,经Giemsa染色,显微镜下观察,杂交瘤细胞的染色体数目均在99-107条之间,基本是小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞染色体数目之和。3 CL单克隆抗体生产及其性质鉴定选取抗体活性最高的1A2株杂交瘤细胞生产了腹水型单克隆抗体和杂交瘤细胞培养液上清型单克隆抗体。用建立的ELISA法测定杂交瘤细胞培养液上清及小鼠腹水抗体效价分别为104和106,用夹心ELISA法建立了小鼠IgG标准曲线,根据标准曲线计算出杂交瘤细胞培养液上清及小鼠腹水中含有效抗体浓度分别为32.80ug/mL和4.48mg/mL。间接竞争ELISA法检测出抗体与BSA及几种CL结构类似物均无交叉反应;Western-blot实验结果显示:抗体与CL-BSA有明显的反应条带,而与BSA则没有明显的反应条带。进一步证明抗体是特异针对CL的。用ELISA法间接得出抗体亲和常数为2.90×1010 L/mol,说明抗体具有较高的亲和力。用不同浓度硫酸铵逐级沉淀腹水后,用SDS-PAGE电泳和间接竞争ELISA法检测出CL的有效抗体存在于50%硫酸铵盐析后的沉淀中。将50%硫酸铵盐析后的沉淀再用免疫亲和层析技术对其进一步纯化,同样用SDS-PAGE和ELISA法检测纯化效果及抗体活性,表明得到了高纯度的抗CL单克隆抗体。用SDS-PAGE确定了抗体分子量为83kd;纯化后抗体效价达105。采用间接竞争ELISA法建立了抗体检测标准曲线,得到IC50值为14.554ng/mL,最低检出限为1.0ng/mL。本实验用消减免疫法免疫小鼠制备抗CL单克隆抗体,钝化了免疫原中的干扰物BSA的免疫原性,提高了获得抗CL单克隆抗体分泌型杂交瘤细胞的机率,减少了在制备单克隆抗体时筛选的工作量,并获得了高特异性的抗CL单克隆抗体。为进一步研制CL免疫检测试剂盒打下了基础。