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胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，该类肿瘤患者预后差，中位生存时间仅为14个月。GBM在脑中呈浸润式生长，能够侵袭到周围正常的脑组织中，因此通过联合放化疗进行手术切除的方法进行治疗仍难以将其治愈，且治疗后GBM仍具有极高的复发率。GBM中存在的肿瘤干细胞是其成为恶性肿瘤的首要原因。GBM肿瘤干细胞具有自我更新能力、高侵袭水平以及无限增殖能力。目前尚无有效针对GBM的治疗方法。氢分子是相对分子质量最小的气体分子，随着氢分子选择性抗氧化作用的发现，氢分子医学作为一门新兴的研究领域得到越来越多的关注，近年来大量研究表明其具有巨大的治疗潜能。
本研究首先在体外细胞水平对氢分子作用于GBM细胞C6和U87进行研究，通过对细胞增殖、迁移及肿瘤干细胞相关特性的检测，发现了氢分子在体外对GBM细胞的抑制作用。为进一步验证氢分子对体内GBM形成的影响，本研究通过建立大鼠原位脑胶质瘤模型及免疫缺陷鼠皮下异种移植人U87恶性胶母细胞模型，研究氢分子在动物体内的作用。结果表明与体外细胞结果相一致，氢分子对动物体内形成的GBM具有明显地抑制作用，显著降低GBM肿瘤干细胞标志物CD133的表达，有效延长了实验动物的中位生存期。本研究还分别使用了iTRAQ联合LS-MS/MS技术以及RNA-Seq二代测序技术，对氢分子处理后的人U87细胞在蛋白组水平及基因组水平的影响进行分析。结果表明，氢分子对U87细胞的抑制作用涉及了细胞代谢、p53通路等多种信号通路，为氢分子应用于GBM的治疗提供了新的思路。主要结果如下:
(1)本研究使用大鼠C6脑胶质瘤细胞系和人U87恶性胶母细胞系作为GBM模式细胞，并经过含氢培养基对细胞进行培养后进行多种指标的检测。其中CCK-8细胞活性检测表明氢分子能够抑制细胞增殖，且在肿瘤细胞增殖旺盛期具有较强的抑制作用。通过流式细胞术对细胞周期及凋亡水平进行检测发现氢分子具有阻滞GBM细胞有丝分裂并促进细胞凋亡的作用。同时细胞划痕和侵袭实验结果表明氢分子能够显著抑制细胞运动能力。肿瘤干细胞相关特性研究中，本研究使用了悬浮肿瘤球培养和平板克隆实验进行检测，结果表明对照组细胞中存在一定比例的具有自我更新能力的肿瘤干细胞，含氢培养后肿瘤干细胞自我更新及无限增殖潜能均受到氢分子的抑制。通过流式及细胞免疫荧光实验对GBM肿瘤干细胞标志物CD133及干细胞分化标志物GFAP蛋白进行检测，结果表明，与对照组相比含氢培养后CD133表达水平显著降低，同时GFAP细胞荧光检测结果表明氢分子促进了细胞的分化。体外细胞结果表明氢分子能够通过抑制肿瘤干细胞标志物CD133的表达抑制肿瘤细胞活性，并通过促进细胞分化，抑制GBM在体外的增殖水平及肿瘤干细胞自我更新、无限增殖及高度侵袭能力。
(2)本研究成功建立大鼠原位脑胶质瘤模型及免疫缺陷小鼠皮下异种移植模型，并使实验组动物每日呼吸有效浓度的氢氧混合气体，以检测氢分子对体内GBM形成的影响。通过MRJ检测大鼠脑原位肿瘤的生长情况，结果表明与对照组相比，呼吸氢气后大鼠颅内脑胶质瘤体积显著减小，肿瘤边界清晰且血管生成水平降低，肿瘤内部核心凋亡区减小。同时，生存曲线数据结果表明，呼吸氢气后患GBM肿瘤大鼠的中位生存期提高了三天，较对照组有显著性提升。小鼠皮下肿瘤模型结果表明氢分子抑制了体内肿瘤的生长，肿瘤体积和质量均显著低于对照组。同时对两种动物模型不同处理形成的肿瘤组织进行取样检测。病理组织切片结果表明，两种模型中，氢分子均能抑制肿瘤干细胞标志物CD133、Nestin的表达。与对照组相比，呼吸氢气后，动物体内形成的肿瘤活性指标Ki-67以及血管生成指标CD34阳性细胞数显著降低。随后对小鼠皮下肿瘤进行蛋白免疫印迹及RT-PCR实验进行检测，结果表明氢分子显著抑制肿瘤干细胞标志物CD133及SOX2蛋白的表达并提高了GFAP的表达水平，另外对肿瘤干细胞核心信号通路P13刚AKT相关蛋白及基因进行检测，发现氢分子能够通过抑制AKT磷酸化提高PTEN基因的表达抑制P13K/AKT信号通路的活化。
(3)本研究通过iTRAQ联合LC-MS/MS技术及RNA-Seq二代测序技术对氢分子处理后人U87细胞在蛋白组、基因组以及代谢组水平进行检测分析。通过KEGG富集表明，氢分子处理后，上调表达的差异蛋白及基因富集在p53信号通路、核糖体及剪接体相关信号通路，下调的差异蛋白质及基因主要富集在氧化磷酸化RNA转运相关信号通路以及钙调节信号通路。综合蛋白组及基因组结果发现，氢分子对人U87恶性胶母细胞在肿瘤代谢水平具有显著抑制作用。同时，代谢组结果表明氢分子作用后肿瘤代谢密切相关的多种代谢物质水平变化验证了氢分子对U87细胞的抑制作用，
通过体外细胞实验及动物体内GBM模型实验验证了氢分子对GBM的抑制作用，由于氢分子特殊的特性，极易穿透各类膜组织可直接在蛋白及基因水平产生影响。因此氢分子对GBM的作用机制仍需要使用更先进的技术手段进行检测和分析。本研究首次证明了氢分子对恶性肿瘤GBM的治疗作用，并为将来在临床上使用氢分子与其他抗肿瘤药物联合治疗或独立治疗提供了理论基础，为针对GBM患者探索新的治疗手段带来了新思路。
本研究首先在体外细胞水平对氢分子作用于GBM细胞C6和U87进行研究，通过对细胞增殖、迁移及肿瘤干细胞相关特性的检测，发现了氢分子在体外对GBM细胞的抑制作用。为进一步验证氢分子对体内GBM形成的影响，本研究通过建立大鼠原位脑胶质瘤模型及免疫缺陷鼠皮下异种移植人U87恶性胶母细胞模型，研究氢分子在动物体内的作用。结果表明与体外细胞结果相一致，氢分子对动物体内形成的GBM具有明显地抑制作用，显著降低GBM肿瘤干细胞标志物CD133的表达，有效延长了实验动物的中位生存期。本研究还分别使用了iTRAQ联合LS-MS/MS技术以及RNA-Seq二代测序技术，对氢分子处理后的人U87细胞在蛋白组水平及基因组水平的影响进行分析。结果表明，氢分子对U87细胞的抑制作用涉及了细胞代谢、p53通路等多种信号通路，为氢分子应用于GBM的治疗提供了新的思路。主要结果如下:
(1)本研究使用大鼠C6脑胶质瘤细胞系和人U87恶性胶母细胞系作为GBM模式细胞，并经过含氢培养基对细胞进行培养后进行多种指标的检测。其中CCK-8细胞活性检测表明氢分子能够抑制细胞增殖，且在肿瘤细胞增殖旺盛期具有较强的抑制作用。通过流式细胞术对细胞周期及凋亡水平进行检测发现氢分子具有阻滞GBM细胞有丝分裂并促进细胞凋亡的作用。同时细胞划痕和侵袭实验结果表明氢分子能够显著抑制细胞运动能力。肿瘤干细胞相关特性研究中，本研究使用了悬浮肿瘤球培养和平板克隆实验进行检测，结果表明对照组细胞中存在一定比例的具有自我更新能力的肿瘤干细胞，含氢培养后肿瘤干细胞自我更新及无限增殖潜能均受到氢分子的抑制。通过流式及细胞免疫荧光实验对GBM肿瘤干细胞标志物CD133及干细胞分化标志物GFAP蛋白进行检测，结果表明，与对照组相比含氢培养后CD133表达水平显著降低，同时GFAP细胞荧光检测结果表明氢分子促进了细胞的分化。体外细胞结果表明氢分子能够通过抑制肿瘤干细胞标志物CD133的表达抑制肿瘤细胞活性，并通过促进细胞分化，抑制GBM在体外的增殖水平及肿瘤干细胞自我更新、无限增殖及高度侵袭能力。
(2)本研究成功建立大鼠原位脑胶质瘤模型及免疫缺陷小鼠皮下异种移植模型，并使实验组动物每日呼吸有效浓度的氢氧混合气体，以检测氢分子对体内GBM形成的影响。通过MRJ检测大鼠脑原位肿瘤的生长情况，结果表明与对照组相比，呼吸氢气后大鼠颅内脑胶质瘤体积显著减小，肿瘤边界清晰且血管生成水平降低，肿瘤内部核心凋亡区减小。同时，生存曲线数据结果表明，呼吸氢气后患GBM肿瘤大鼠的中位生存期提高了三天，较对照组有显著性提升。小鼠皮下肿瘤模型结果表明氢分子抑制了体内肿瘤的生长，肿瘤体积和质量均显著低于对照组。同时对两种动物模型不同处理形成的肿瘤组织进行取样检测。病理组织切片结果表明，两种模型中，氢分子均能抑制肿瘤干细胞标志物CD133、Nestin的表达。与对照组相比，呼吸氢气后，动物体内形成的肿瘤活性指标Ki-67以及血管生成指标CD34阳性细胞数显著降低。随后对小鼠皮下肿瘤进行蛋白免疫印迹及RT-PCR实验进行检测，结果表明氢分子显著抑制肿瘤干细胞标志物CD133及SOX2蛋白的表达并提高了GFAP的表达水平，另外对肿瘤干细胞核心信号通路P13刚AKT相关蛋白及基因进行检测，发现氢分子能够通过抑制AKT磷酸化提高PTEN基因的表达抑制P13K/AKT信号通路的活化。
(3)本研究通过iTRAQ联合LC-MS/MS技术及RNA-Seq二代测序技术对氢分子处理后人U87细胞在蛋白组、基因组以及代谢组水平进行检测分析。通过KEGG富集表明，氢分子处理后，上调表达的差异蛋白及基因富集在p53信号通路、核糖体及剪接体相关信号通路，下调的差异蛋白质及基因主要富集在氧化磷酸化RNA转运相关信号通路以及钙调节信号通路。综合蛋白组及基因组结果发现，氢分子对人U87恶性胶母细胞在肿瘤代谢水平具有显著抑制作用。同时，代谢组结果表明氢分子作用后肿瘤代谢密切相关的多种代谢物质水平变化验证了氢分子对U87细胞的抑制作用，
通过体外细胞实验及动物体内GBM模型实验验证了氢分子对GBM的抑制作用，由于氢分子特殊的特性，极易穿透各类膜组织可直接在蛋白及基因水平产生影响。因此氢分子对GBM的作用机制仍需要使用更先进的技术手段进行检测和分析。本研究首次证明了氢分子对恶性肿瘤GBM的治疗作用，并为将来在临床上使用氢分子与其他抗肿瘤药物联合治疗或独立治疗提供了理论基础，为针对GBM患者探索新的治疗手段带来了新思路。