Gelonin是从大戟科植物何首乌(Gelonium multiflorum)种子中分离出来的一种植物毒素。它属于I型核糖体失活蛋白,可以通过切割真核28S核糖体RNA 4324位点的腺嘌呤,诱导核糖体不可逆失活,从而抑制蛋白质合成。Gelonin缺少与细胞膜结合的结构域,因此它对完整的细胞是相对无毒的。尽管少量的Gelonin可以通过内吞方式进入细胞,抑制蛋白质的合成,促进细胞凋亡,但是细胞摄取量很低,而且缺乏组织特异性。因此提高Gelonin的细胞内化效率,同时增强其对肿瘤细胞的靶向性,对于提高其抗肿瘤活性是至关重要的。由于肿瘤细胞的Warburg效应,肿瘤微环境pH值要略低于正常组织。根据肿瘤细胞由于形成酸性微环境,低pH插入肽(pH low insertion peptide,pHLIP)可以在酸性条件下形成跨膜α螺旋,将其C端插入细胞膜且不会破坏细胞膜的通透性。本课题通过原核表达系统成功表达了重组Gelonin(recombinant gelonin,rGel)以及由硫氧还蛋白标签(Trx)、pHLIP和Gelonin组成的重组蛋白Trx-pHLIP-Gelonin(TpG)。本论文主要包括以下三部分研究内容:(1)采用传统的双酶切法、全质粒PCR和无缝克隆等技术构建重组质粒pET28a-pHLIP-Gelonin、pET28a-Gelonin、pGEX-4T-1-pHLIP-Gelonin、pET32a-pHLIP-Gelonin。经过菌落PCR和测序鉴定,以上重组质粒均构建成功。(2)将构建好的重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)或者E.coli BL21中,通过摸索表达条件之后,最终分别选择用pET28a-Gelonin和pET32a-pHLIP-Gelonin表达重组蛋白rGel和TpG。两种重组蛋白均带有His标签,通过镍离子亲和层析柱纯化得到重组蛋白rGel和TpG。经SDS-PAGE鉴定及灰度分析得出蛋白的纯度分别达到95%和90%以上。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析表明rGel和TpG的分子量分别为20613 Da和50923 Da,序列覆盖率分别为48%和37%,表明两种蛋白均正确表达。通过圆二色谱测定了rGel的二级结构和热稳定性,其主要二级结构为β-折叠和无规卷曲,且在20-60°C范围内具有良好的热稳定性。(3)通过MTT检测rGel对两种结肠癌细胞HCT116和HCT-8的细胞毒性。rGel对HCT116和HCT-8细胞生长的抑制作用具有剂量和时间依赖性。10μM rGel处理72 h后,HCT116和HCT-8的细胞抑制率分别为对照组的52.50%和44.31%。通过测定细胞内的蛋白水平,检测rGel的N-糖苷酶活性。与MTT结果一致,rGel以剂量和时间依赖的方式抑制细胞内蛋白质合成。在用10μM rGel处理72 h后,HCT116和HCT-8细胞中的相对细胞蛋白水平分别为对照组的14.56%和35.62%。综上所述,我们成功构建了重组蛋白的表达载体pET28a-Gelonin和pET32a-pHLIP-Gelonin,成功表达了重组蛋白rGel和TpG。细胞实验表明,rGel可以通过内吞作用进入肿瘤细胞内,抑制细胞内蛋白质的合成,诱导肿瘤细胞凋亡。