椎间盘源性下腰痛是骨科临床的常见病和多发病，随着人们生活节奏的加快，工作强度的增加，呈逐年上升的趋势，已经成为严重影响人们日常生活和工作的主要疾病之一，但其病因和发病机制目前尚不完全清楚。椎间盘源性下腰痛的早期缺乏有效特异性的治疗方法，椎间盘摘除、椎间融合和椎间盘置换是中晚期的主要治疗方法，但单纯摘除疗效差，易复发；椎间融合不仅牺牲了该节椎间盘的功能，且加速了临近节段的退变；椎间盘置换也因材料的特殊性和与椎体固定的难度而不能很好的解决这一问题，因此迫切需要探索其发病机制，寻找新的治疗方法。研究表明，神经纤维只存在于正常椎间盘纤维环的外层，而在有下腰痛症状的退变的椎间盘纤维环的内层，甚至髓核内均发现了神经纤维的存在，而无腰痛症状的患者却没有发现其存在，说明疼痛椎间盘中，神经纤维是生长的，且和疼痛密切相关，并有学者在摘除的椎间盘内发现了GAP-43的表达。这些现象在疼痛椎间盘内发现，表明神经长入退变的椎间盘内可能是椎间盘源性下腰痛的一个主要原因。许多研究证实，椎间盘在退变过程中，可产生大量炎症介质及退变产物，诱导椎间盘内部成炎症状态。目前国内外学者对盘源性下腰痛的研究多集中在此炎症变化上，而对炎症状态下椎间盘内部神经纤维的长入及其机制尚缺乏系统深入的研究。GAP-43是一种神经特异性的磷蛋白，与神经的生长、发育和再生过程密切相关。GAP-43通过引导轴突生长和调节新连接形成而影响轴突的生长能力，即使在缺乏其它营养因子时也能使神经元发出新的终末，所以GAP-43被认为是神经元生长期的内在决定因子，可作为神经再生的标志。最近许多研究认为，GAP-43和椎间盘退变时神经纤维的长入有密切的关系。因此通过研究椎间盘炎症状态下椎间盘及初级神经元背根神经节中GAP-43的表达变化，可以探索椎间盘炎症环境下神经长入病变椎间盘的促进因素，进而探讨椎间盘源性下腰痛的微观分子机制，为椎间盘源性下腰痛寻找新的治疗途径，有着重要的意义。本论文的内容分以下三个部分：第一部分：大鼠椎间盘炎症模型的建立与观察目的：用HE染色观察大鼠椎间盘内注射弗氏佐剂后不同时间椎间盘内炎症的变化情况。方法：正常成年雄性S-D大鼠(n=17，200—250g)，随机分为实验组(n=12)、对照组(n=4)和空白对照组(n=1)。实验组大鼠经L5，6椎间盘腹侧注射50μl弗氏佐剂，对照组注射50μl生理盐水。术后1，3，7，14天分别将动物处死，取L5，6椎间盘，行石蜡包埋、切片，HE染色。结果：注射弗氏佐剂后1天，椎间盘组织内即有大量炎性细胞浸润，组织水肿。3天时炎性细胞浸润有所减轻，可见纤维组织增生。7天时炎性细胞浸润明显减少，纤维组织部分胶原化。14天时纤维组织明显胶原化，少量炎性细胞浸润。对照组仅在1天见少量炎性细胞浸润。正常椎间盘组织内为软骨和纤维组织。结论：大鼠椎间盘内注射弗氏佐剂诱导了椎间盘内的炎症状态。第二部分：神经生长相关蛋白43在大鼠椎间盘炎症模型中表达的荧光免疫组化研究目的：用荧光免疫组化方法检测椎间盘炎症环境下椎间盘内及背根神经节中GAP-43在不同时期与对照组的表达变化。方法：正常成年雄性S-D大鼠(n=61，200—250g)，随机分为实验组(n=24)、对照组(n=24)、注射NGF组(n=9)和空白对照组(n=4)。在L5，6椎间盘应用荧光金追踪7天后，实验组椎间盘经腹侧注射50μl弗氏佐剂，对照组注射50μl生理盐水。术后1，3，7，14天分别处死，取T13-L6背根神经节和L5，6椎间盘，双染NGF和CGRP；GAP-43和CGRP、IB4。注射NGF组在L5，6椎间盘应用荧光金追踪7天后，实验组椎间盘经腹侧分别注射301μl含1μg(n=3)和10μgNGF(n=3)的生理盐水，对照组注射301μl生理盐水(n=3)，术后3天处死，取T13-L6背根神经节，行GAP-43的表达检测。结果：1、炎症组GAP-43在术后1天开始升高，3天达到高峰，与对照组相比，差异呈显著性(p＜0.01)，以后逐步下降。2、炎症组NGF在术后1天即快速升高，与对照组相比，差异呈显著性(p＜0.01)，以后逐步下降。3．椎间盘内注射不同剂量鼠神经生长因子后3天，DRG神经元中GAP-43的表达在1μg组和10μg组均较生理盐水组有明显的增加，10μg组与1μg组和生理盐水组相比，差异呈显著性(p＜0.01)。4、GAP-43与CGRP、IB4的双染显示，在对照组，85.8％(33个中的28)GAP-43阳性神经元表达CGRP，而没有IB4连接的糖蛋白的表达；在炎症组，89.5％(48中的43个)GAP-43阳性神经元表达CGRP阳性，同样没有IB4连接的糖蛋白的表达。5、DRG神经元中支配腰椎间盘的GAP-43免疫活动神经元的横截面积测量显示，在对照组，GAP-43免疫活动神经元只在中小面积的F-G标记神经元中；而在炎症组中，发现了一些较大的GAP-43免疫活动神经元，但F-G标记的神经元的GAP-43免疫阳性细胞的平均横截面积，实验组和对照组差异无显著性。6、在炎症组和对照组，仅在纤维环的外层观察到了神经纤维的表达。在对照组，GAP-43免疫活动神经元发现的较少(24个中的8个)，而在炎症组却频繁发现(24个中的17个)。CGRP免疫活动神经纤维在两组的所有样本中均有较多的发现，而IB4连接的糖蛋白在两组中均没有发现阳性纤维表达。GAP-43在炎症组较多表达在弗氏佐剂的周围。结论：椎间盘炎症状态下刺激了炎症局部NGF的高表达；椎间盘炎症环境刺激了椎间盘和DRG中GAP-43的高表达，其高表达晚于NGF的高表达；椎间盘内注射不同剂量的NGF后GAP-43不同程度的上调证实了两者可能存在相关性；GAP-43阳性神经元以中小神经元为主，这些神经元较大的神经元更易长入炎症椎间盘。第三部分：神经生长相关蛋白43在大鼠椎间盘炎症模型背根神经节中mRNA水平的表达研究目的：用原位杂交和RT-PCR检测椎间盘炎症环境下大鼠背根神经节中GAP-43mRNA在不同时期与对照组的表达变化。方法：正常雄性S-D大鼠(n=51只，200-250g)，随机分为实验组(n=24，原位杂交和RT-PCR各半)，对照组(n=24，原位杂交和RT-PCR各半)，和空白对照组(n=3，RT-PCR)在实验组L5，6椎间盘腹侧注射50μl弗氏佐剂，对照组注射50μl生理盐水。术后1，3，7，14天分别处死，取T13-L6背根神经节，分别行GAP-43的原位杂交和RT-PCR检测。结果：1、原位杂交显示GAP-43免疫阳性颗粒表达在细胞胞浆中，阳性细胞以中小神经元数量居多、染色深，免疫反应强；而大细胞数量少，染色浅。2、原位杂交细胞记数和RT-PCR定量显示，GAP-43mRNA在术后1天明显升高，炎症组和对照组相比，差异呈显著性(P＜0.01)。以后逐渐的下降，两者差异无显著性。结论：椎间盘炎症状态刺激了背根神经节中GAP-43mRNA水平的高表达，其表达早于免疫组化蛋白的表达，进而促进了GAP-43蛋白的的高表达，两者存在相关性；原位杂交免疫阳性细胞以中小细胞神经元为主，这些神经元具有更强的再生能力，较大神经元更易长入炎症的椎间盘中。