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第一部分小鼠血管内膜增生模型的的构建目的:构建小鼠血管内膜增生模型,探讨其引起内膜增生和管腔狭窄的相关机制。方法:根据文献报道的方法[1],使用硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生,对照侧实行假手术,分离股动脉后不进行套管。手术后进行体重连续监测,取血管进行组织形态分析前用小动物超声仪检测小鼠双侧股动脉内血流的变化,作为再狭窄形成的辅助诊断指标。通过对实验处股动脉切片进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE staining)来判断血管内新生内膜的面积和管腔狭窄的程度,分别对内膜面积,中膜面积,内膜与中膜的比例(I/M)用ImageJ软件处理后进行定量。结果:经测定,与假手术侧相比,小鼠股动脉手术侧的血流速度[(126.2334±21.43199)vs(70.97854±4.646153),P=0.002]显著加快,差异有统计学意义,即手术侧管腔的横截面积小于对照侧。取小鼠股动脉切片后进行HE染色,可见血管内膜显著增生和管壁增厚及管腔狭窄。内膜中可见大量的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增生,血管周可见炎性细胞浸润。血管狭窄参数的定量结果显示,手术侧的内膜面积[(2563.67±398.31)vs(7974.67±1491.69),P=0.004],中膜面积[(6939.67±570.507)vs(12227.67±1487.02),P=0.005],I/M 比值[(0.37±0.04)vs.(0.66±0.13),P=0.019]都明显高于对照侧(图3D),差异有统计学意义。结论:成功构建了简单实用的通过血管外膜损伤诱导小鼠股动脉内膜增生的模型。第二部分体外评价阿苯达唑对平滑肌细胞生物学功能的影响目的:利用体外实验评价阿苯达唑(Albendazole,ABZ)对VSMCs生物学功能的影响并简要探讨其作用机制。方法:体外各实验均用与实验组等体积的DMSO作为对照,且DMSO在培养基中的浓度≤0.2%。MTT法检测ABZ对VSMCs和内皮细胞(endothelial cell,ECs)增殖的影响,3-D细胞迁移实验和Annexin V-PI染色分别评估ABZ对VSMCs迁移和凋亡的影响。细胞划痕实验用来评估ABZ对ECs迁移的影响。在VSMCs体外迁移的过程中,使用特异性鬼笔环肽荧光染料标记丝状肌动蛋白(F-actin),用来反映ABZ对细胞骨架结构变化的影响。免疫印迹法(Western blotting)检测肌球蛋白磷酸酶1(MYPT1)和肌球蛋白轻链2(MLC)磷酸化水平的变化。结果:MTT实验检测结果显示,与对照组相比,ABZ以0.5μM[(0.60±0.03)vs(0.50±0.04),P<0.001]1μM[(0.60±0.03)vs(0.33±0.03),P<0.001]浓度作用 48h后,均能显著抑制VSMCs的增殖,最小起效浓度为0.5μM。细胞迁移实验结果显示,与对照组相比,ABZ 以 0.5μM[(118.55±3.39)vs(81.00±4.00),P<0.001]和1μM[(118.55±3.39)vs 78.875±3.01),P<0.001]浓度作用 48h 时后对 VSMCs 迁移具有抑制作用,穿过胶原贴附到Transwell小室膜外侧的细胞数显著减少。流式细胞术检测结果表明,ABZ作用48h后,0.5μM浓度对细胞凋亡没有显著影响[(18.29±2.79)vs(20.02±2.23),P=0.420],但在 1.0μM时可以促进细胞凋亡[(18.29±2.79)vs(25.13+1.35),P=0.002]。本实验室之前的实验研究表明,ABZ将VSMCs的细胞周期阻滞在G2/M期。使用MTT细胞增殖试剂盒对ECs的检测结果表明,与对照组相比,ABZ处理48h,0.5μM[(0.34±0.11)vs.(0.42±0.09),P=0.146]和 1μM[(0.34±0.11)vs.(0.40±0.10),P=0.427]浓度对ECs的增殖作用均未见显著的抑制作用。细胞划痕实验用来体外模拟ABZ对ECs损伤愈合的影响,ImageJ软件分别对Oh和24h划痕愈合的面积进行定量。愈合面积用Oh划痕面积与24h划痕面积之差表示。相较于对照,ECs 经过 0.5μM[(85423.89±29521.03)vs(18211.33±4985.28),P<0.01]和 1μM[(85423.89±29521.03)vs(21810.00±17750.62),P<0.001]ABZ 处理 24h 后,创面愈合面积都具有明显差异。Western blot检测结果显示,与对照相比,0.5μM[(0.64±0.12)vs(0.37±0.12),P=0.04]和1.0μM[(0.64±0.12)vs(0.24±0.07),P=0.007]ABZ 分别作用24h后,MYPT1磷酸化水平显著降低。MLC磷酸化水平在0.5μM[(0.89±0.06)vs(0.56±0.13),P=0.01]和 1μM[(0.89±0.06)vs(0.34±0.08),P<0.001]ABZ 处理后也显著降低。结论:ABZ能够在体外抑制VSMCs增殖和迁移,对细胞凋亡影响较小,并且不会影响ECs的增殖作用。ABZ对VSMCs迁移的影响与细胞骨架中F-actin的拆解有关,能够显著抑制F-actin的拆解,其机制可能与ABZ对MLC和MYPT1磷酸化水平的调节有关。第三部分阿苯达唑对小鼠股动脉内膜增生和管壁重塑的影响目的:利用小鼠血管内膜增生模型评价ABZ在体内对小鼠股动脉损伤后再狭窄形成的影响,探讨ABZ成为血管再狭窄潜在预防药物的可能。方法:取10周龄野生型雄性C57BL/6小鼠,硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生模型,对侧实行假手术。术后将小鼠随机分为实验组和对照组,两组小鼠同时用高脂饲料喂养。期间实验组将ABZ以1.5 mg/天的剂量进行灌胃,对照组以同体积的芝麻油灌胃。4周后用小动物超声仪评价血管内膜增生的严重程度。HE染色后观察血管组织的形态学变化,ImageJ软件处理后对内膜面积,中膜面积及内膜与中膜的比例(I/M)进行定量。通过免疫组织化学染色评价平滑肌细胞表型转换分子(α-SMA),内皮细胞标记(CD31),巨噬细胞标记(Mac-3),以及平滑肌细胞核增殖抗原(PCNA)表达的变化。结果:与对照组相比,实验组小鼠双侧股动脉内血流速度的差值[(40.37±2.88)vs(25.08±7.37),P=0.008]减低,差异有统计学意义,即ABZ作用后股动脉血管腔的横截面积大于对照侧,狭窄程度得到改善。HE染色结果表明,相较于对照组小鼠,ABZ 能够显著抑制内膜[(5605.79±1246.96)vs(2988.66±365.58),P=0.017]增生及I/M的比例[(1.12±0.20)vs(0.76±0.15),P=0.005],对中膜的面积并无显著效应[(4114.46±970.57)vs(3913.79±528.51),P=0.661]。免疫组化染色结果显示,α-SMA阳性细胞显著减少[(0.35±0.02)vs(0.21±0.04),P=0.008]。CD31染色结果表明,ABZ不会影响再内皮化。PCNA染色结果显示ABZ处理后,PCNA阳性细胞数明显减少[(0.32±0.03)vs(0.20±0.04),P=0.007]。与对照组相比,巨噬细胞阳性数也减少[(0.08±0.02)vs(0.04±0.01),P=0.03]。结论:ABZ通过作用于VSMCs和炎症细胞,有效的改善了动脉内膜增生和血管壁重塑,对术后血管再狭窄的形成具有较好的预防作用。