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胃癌（Gastric cancer,GC）的发生是一个多阶段和多因素的病理过程。虽然在过去的几十年中发现了许多潜在的胃癌发生及发展的机制,但延迟的诊断和治疗仍是导致胃癌患者高死亡率的主要原因。因此,识别胃癌的分子模式及其特异性的生物标志物对开发靶向治疗胃癌的方法至关重要。此外,化疗作为手术治疗之外胃癌的主要辅助治疗方式,往往因耐药而失败,迫切需要探索药物耐药的机制和寻找逆转耐药的新方法。环状RNA（Circular RNA,circRNA）是近年来发现的一种具有特殊结构的非编码RNA,在真核生物中广泛存在,主要分布于细胞质中。CircRNA作为miRNA的分子海绵参与基因调控,阻断miRNA抑制其相关靶基因的作用。此外,circRNA也可通过结合RNA结合蛋白进而调节基因表达。CircRNA的异常表达与肿瘤的发生及发展等过程密切相关,基于其稳定性、表达特异性的特点,circRNA预期可成为早期诊断癌症的生物标志物或治疗癌症的潜在靶点。虽然在胃癌组织中发现了具有功能的circRNA,但大多数研究都集中在其与病理特征的关系上,circRNA参与调控胃癌发生发展及化疗耐药等方面的报道甚少,胃癌相关circRNA的表达谱仍需要深入研究。本研究利用生物信息学的方法,通过将差异表达的circRNA挖掘出来,构建circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络、PPI网络并筛选关键基因,勾画出胃癌的表达谱信息特征,同时得到hsacirc0001546调控hsa-miR-421靶向ATM的核心子网络,并通过胃癌组织、患者血浆、胃癌细胞系的RT-PCR进行验证。然后进一步探讨hsacirc0001546调控胃癌发生发展及化疗耐药等的分子机制,为胃癌早期诊断及精准治疗提供新的方向。第一部分基于GEO数据库的胃癌circRNA表达谱研究目的:利用生物信息学方法,整合多种生物信息平台数据,挖掘差异表达circRNA并研究其调控机制,旨在筛选胃癌中的关键基因及其信号转导通路。方法:从GEO数据库下载circRNA芯片数据;经过批次校正后获得差异表达circRNA;运用在线数据库预测差异表达的circRNA的miRNA的结合位点及潜在调控的miRNA;构建circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络;进行GO富集分析及KEGG通路富集分析,通过STRING工具构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络并可视化。筛选关键基因并通过UALCAN和Kaplan-Meier plotter数据库初步验证。结果:将筛选得到的4个GEO数据库批次校正,进一步筛选得到27个差异表达circRNA,发现hsacirc0001546在胃癌组织中低表达,在正常组织中高表达,区分度最佳;然后构建了包含3个circRNA和12个miRNA和138个mRNA的circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络。进一步对差异表达mRNA进行GO富集分析和KEGG通路富集分析;随后构建PPI网络并筛选出10个关键基因,再通过数据库进一步验证筛选的关键基因确实在胃癌中差异表达,且多数基因与胃癌生存率相关。结论:通过数据挖掘建立胃癌的circRNA表达谱,找到hsacirc0001546调控hsa-miR-421靶向ATM/CASP3的核心子网络可作为胃癌研究的新靶点。第二部分Hsacirc0001546在胃癌组织、血浆及胃癌细胞中的表达目的:检测hsacirc0001546在胃癌组织、血浆及常见胃癌细胞系中的表达方法:通过qRT-PCR实验分别检测hsacirc0001546在83对胃癌及癌旁组织中表达水平;检测hsacirc0001546在胃癌切除患者术前和手术后血浆中的水平;在正常胃粘膜细胞和胃癌细胞系MKN-45、HGC-27、HGC-27/L-OHP、AGS、SGC-7901 和 BGC-823 中的表达。结果:qRT-PCR结果表明与癌旁组织相比,hsacirc0001546在胃癌组织中的表达量显著降低;胃癌术后1月患者血浆hsacirc0001546的水平明显高于术前;相比于正常人胃粘膜上皮细胞,hsacirc0001546在胃癌细胞系中表达下调;hsacirc0001546的表达水平与肿瘤大小、肿瘤浸润情况显著相关;hsacirc0001546低表达组患者的中位总生存时间较高表达组显著缩短。结论:Hsacirc0001546可能参与胃癌的生长及侵袭过程,对胃癌的诊断及预后评价具有重要的临床应用价值。第三部分Hsacirc0001546在胃癌中的生物学功能研究目的:探究hsacirc0001546在胃癌中的生物学功能。方法:通过转染hsacirc0001546质粒和siRNA分别构建hsacirc0001546稳定过表达和沉默的胃癌细胞系,运用CCK-8增殖实验和平板克隆实验检测胃癌细胞的增殖能力,Transwell实验及划痕实验检测胃癌细胞的迁移和侵袭能力,应用流式细胞仪检测并分析细胞周期变化,通过裸鼠成瘤实验检测体内瘤体生长速率。结果:CCK-8实验和克隆实验表明过表达hsacirc0001546可以抑制胃癌细胞的增殖;划痕实验和Tranwell实验表明过表达hsacirc0001546可以抑制胃癌细胞转移和侵袭;流式细胞术检测结果表明过表达hsacirc0001546可以抑制胃癌细胞的周期进展;裸鼠成瘤实验检测表明过表达hsacirc0001546可以抑制体内瘤体生长速率;而沉默hsacirc0001546则获得相反的结果。结论:过表达hsacirc0001546可以抑制胃癌增殖、转移、侵袭、周期进展,而沉默hsacirc0001546则获得相反的结果。第四部分Hsacirc0001546调控胃癌及其提高化疗敏感性的机制目的:研究hsacirc0001546调控胃癌增殖的分子机制,探究其改善化疗药物耐药性的效果及相关机制。方法:针对第一部分生物信息学预测的hsacirc0001546下游的miRNA,首先应用qRT-PCR进行验证,然后利用RNA-pull down实验和组成双荧光素酶报告基因实验,CCK-8增殖实验深入了解hsacirc0001546对miRNA可能的生物学功能的影响,最后构建L-OHP耐药的HGC-27细胞（HGC-27/L-OHP）,并进一步通过流式细胞术,Western blot和qRT-PCR验证hsacirc0001546对下游miRNA及靶基因表达的作用,应用ATM抑制剂Ku-55933检测ATM、Chk2和p53表达变化。结果:生物信息学预测出13个高分潜在结合的miRNA,RNA pull down实验和qRT-PCR实验表明hsacirc0001546可以作为miR-421的海绵;组成双荧光素酶报告基因实验及共转染实验表明hsacirc0001546与miR-421存在相互作用;过表达 hsacirc0001546 增加了 L-OHP 处理的 HGC-27 细胞和 HGC-27/L-OHP细胞的凋亡率,过表达hsacirc0001546可以部分缓解miR-421 minics对细胞凋亡的抑制作用;qRT-PCR和Western blot实验表明过表达miR-421显著降低了HGC-27细胞中ATM的rmRNA和蛋白的表达水平,而沉默miR-421则起到相反的作用,过表达hsacirc0001546可以显著上调ATM的mRNA和蛋白的表达,逆转了 miR-421 minics对ATM的抑制作用;hsacirc0001546的过表达增加了HGC-27/L-OPH细胞中ATM、Chk2和p53的蛋白表达水平,促进它们的活化,而共转染pcDNA-circ0001546和miR-421 mimics组与对照组无明显差异。Ku-55933 可以抑制转染 pcDNA-circ0001546 的 HGC-27/L-OPH 细胞中 ATM、Chk2和p53的磷酸化。结论:Hsacirc0001546可作为miR-421的分子海绵,通过miR-421靶向作用于ATM,进而激活ATM/Chk2/p53信号通路,抑制细胞增殖,提高胃癌细胞对L-OPH的敏感性。本研究结果表明hsacirc0001546可能是一种潜在的胃癌诊断生物标志物,也是基于铂化合物治疗胃癌患者的有效靶点。全文总结:本研究首先通过生物信息学数据挖掘筛选及qRT-PCR验证了胃癌组织中circRNA的表达,分析了 circRNA与胃癌临床病理参数及预后的关系,然后应用CCK-8实验、克隆实验、划痕实验、流式细胞实验、transwell实验、裸鼠成瘤实验、RNA-pull down实验、组成双荧光素酶报告基因实验和Western blot实验等,探讨了hsacirc0001546在胃癌发生、发展中的作用。最终证明:hsacirc0001546通过作用hsa-miR-421靶向ATM/Chk2/p53的调控网络抑制胃癌的增殖、侵袭及迁移能力,并提高胃癌细胞对L-OPH的敏感性。